本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞與shRNA聯(lián)合治療肝損傷的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的慢性肝炎可以造成肝細(xì)胞損傷。肝纖維化的形成是由于受到多種細(xì)胞因子的刺激,肝內(nèi)星狀細(xì)胞被激活,肝細(xì)胞外基質(zhì)大量合成,以致纖維組織的大量沉積。HBV自身并不會(huì)對(duì)肝臟造成損傷,引起肝細(xì)胞損傷的主要原因是宿主特異性免疫應(yīng)答,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)不僅可以清除HBV,還可以殺傷感染后的肝細(xì)胞。 在本論文中聯(lián)合RNA干擾和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植技術(shù)共同治療肝損傷。RNA干擾(RNA interference, RNAi)通過小干擾RNA (siRNA)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默,為有效的治療HBV感染提供了新方法。在國內(nèi)外的文獻(xiàn)中,有關(guān)利用RNA干擾技術(shù)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的報(bào)道已屢見不鮮。然而,對(duì)于中后期慢性乙肝病毒感染的患者來說,雖然體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制被抑制,但肝損傷程度很嚴(yán)重,肝細(xì)胞已經(jīng)不能進(jìn)行自我修復(fù)。這樣一來,僅使用RNA干擾技術(shù)并不能達(dá)到良好的治療效果。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛,取材方便,無免疫原性,據(jù)報(bào)道無論在體內(nèi)還是體外都有向肝細(xì)胞分化的潛能,并可以遷移到受傷的肝組織進(jìn)行修復(fù),移植后間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子也可以幫助宿主恢復(fù)肝損傷,由此,MSCs是肝移植的理想供體。 我們一方面通過靶向性的小發(fā)夾RNA (small hairpin RNA, shRNA)抑制乙型肝炎病毒在鼠體內(nèi)的復(fù)制：同時(shí),又通過脾內(nèi)注射移植間充質(zhì)干細(xì)胞以修復(fù)模型鼠的肝損傷。這樣,既抑制了乙型肝炎病毒的復(fù)制又改善了肝損傷的程度。 首先我們查閱中外文獻(xiàn)選擇了不同的HBV DNA靶點(diǎn),Lx-shRNA157是以HBV DNA基因組S開放式閱讀框157i為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,Lx-shRNA1694是以HBV DNA基因組X開放式閱讀框1694i為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,Lx-shRNA157-1694為雙靶點(diǎn)shRNA表達(dá)質(zhì)粒。我們合成的三個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒無論在體內(nèi)還是體外對(duì)HBV的復(fù)制都有較好的抑制效果,并且雙靶點(diǎn)Lx-shRNAl57-1694對(duì)HBV復(fù)制的抑制效果都要好于單靶點(diǎn)。 其次我們?cè)隗w外通過特殊培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化,成功將人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUC-MSCs)和小鼠永生型間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse immortal mesenchymal stem cells, mi-MSCs)分化為成骨細(xì)胞和成肝細(xì)胞。并證明了向成肝細(xì)胞分化后的MSCs具有成熟肝細(xì)胞的功能,如：糖原的貯存,尿素的合成等。 乙型肝炎研究困難是因?yàn)镠BV的宿主范圍狹窄,很難找到合適的動(dòng)物模型。最后我們結(jié)合尾靜脈高壓注射法和CCl4誘導(dǎo)法成功構(gòu)建了乙肝病毒肝臟纖維化小鼠模型,使鼠體內(nèi)既有HBV的復(fù)制又有肝纖維化的存在,以模擬慢性HBV感染患者體內(nèi)的環(huán)境。我們聯(lián)合shRNA和MSCs移植技術(shù)治療肝損傷,shRNA可以靶向性地抑制HBV的復(fù)制,MSCs可以修復(fù)受損傷的肝組織。通過ELISA、蛋白質(zhì)免疫印跡法和RT-PCT檢測乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen, HBsAg)和乙型肝炎e抗原(Hepatitis B e Antigen, HBeAg)的含量,研究結(jié)果表明靶向性shRNA確實(shí)可以顯著降低HBsAg和HBeAg的水平,抑制率可達(dá)95%以上。通過天狼星紅染色、肝重／體重以及谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的測定檢測肝細(xì)胞纖維化的程度。通過糖原染色和尿素氮含量的測定以檢測肝功能恢復(fù)的程度。研究結(jié)果表明移植MSCs確實(shí)對(duì)肝損傷有一定的改善作用,移植后的肝臟基本可以恢復(fù)正常的肝功能。 本文通過以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了shRNA和MSCs的作用與功能。將兩種技術(shù)相結(jié)合可以更加有效地治療由HBV感染所致的肝損傷,這為HBV感染的治療提供了新的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 肝損傷 間充質(zhì)干細(xì)胞 小發(fā)夾RNA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-23
• 1.1 HBV概述12-16
• 1.1.1 HBV形態(tài)結(jié)構(gòu)12-13
• 1.1.2 HBV基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)13-14
• 1.1.3 HBV侵入人體的機(jī)制14-15
• 1.1.4 病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)理及肝損傷的形成15-16
• 1.2 RNA干擾概述16-17
• 1.3 MSCs概述17-19
• 1.4 動(dòng)物模型19-21
• 1.5 本文的立體依據(jù)21-23
• 第2章 材料與方法23-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與常規(guī)試劑23-26
• 2.1.1 HBV基因靶點(diǎn)的選擇及質(zhì)粒的構(gòu)建23-24
• 2.1.2 抗體24
• 2.1.3 常規(guī)試劑的配制方法24-26
• 2.2 儀器和設(shè)備26-27
• 2.3 方法與相關(guān)試劑27-37
• 2.3.1 大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)的制備27-28
• 2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染28-29
• 2.3.3 免疫印跡法29
• 2.3.4 ELISA法29
• 2.3.5 MSCs向成骨細(xì)胞分化29-30
• 2.3.6 MSCs向肝細(xì)胞分化30-31
• 2.3.7 茜素紅染色31
• 2.3.8 RT-PCR31-33
• 2.3.9 肝糖原檢測33
• 2.3.10 尿素含量檢測33-34
• 2.3.11 尾靜脈高壓注射法建立急性乙型肝炎小鼠模型34
• 2.3.12 CCl_4肝損傷小鼠模型的建立34-35
• 2.3.13 乙肝病毒肝臟纖維化小鼠模型35
• 2.3.14 小鼠脾內(nèi)移植MSCs35
• 2.3.15 AST、ALT含量的測定35-36
• 2.3.16 天狼星紅染色36-37
• 第3章 結(jié)果與討論37-64
• 3.1 shRNA表達(dá)載體體外抑制HBV復(fù)制及表達(dá)37-43
• 3.1.1 質(zhì)粒的構(gòu)建37-38
• 3.1.2 shRNA抑制HBsAg與HBeAg的表達(dá)38-40
• 3.1.3 shRNA對(duì)HBV mRNA的降解作用40-41
• 3.1.4 小結(jié)41-43
• 3.2 shRNA表達(dá)載體體內(nèi)抑制HBV復(fù)制及表達(dá)43-48
• 3.2.1 尾靜脈高壓注射法注射結(jié)果43-44
• 3.2.2 shRNA抑制HBsAg與HBeAg的表達(dá)44-46
• 3.2.3 shRNA表達(dá)載體在體內(nèi)降解HBsAg mRNA46-47
• 3.2.4 天狼星紅染色47-48
• 3.2.5 小結(jié)48
• 3.3 MSCs向成骨細(xì)胞分化48-50
• 3.3.1 茜素紅染色49-50
• 3.3.2 小結(jié)50
• 3.4 MSCs向成肝細(xì)胞分化50-55
• 3.4.1 細(xì)胞形態(tài)變化51
• 3.4.2 分化過程中肝特異性蛋白的表達(dá)51-53
• 3.4.3 肝功能檢測53-54
• 3.4.4 小結(jié)54-55
• 3.5 MSCs與shRNA聯(lián)合治療乙肝病毒肝臟纖維化小鼠55-64
• 3.5.1 shRNA抑制HBsAg與HBeAg的表達(dá)56-58
• 3.5.2 肝重/體重58-59
• 3.5.3 ALT、AST含量檢測59-60
• 3.5.4 天狼星紅染色60-61
• 3.5.5 小結(jié)61-64
• 討論64-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞與shRNA聯(lián)合治療肝損傷的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：321749