發(fā)布時(shí)間：2021-04-02 12:24

　　反應(yīng)活性氧的產(chǎn)生與清除失衡,會(huì)導(dǎo)致組織和細(xì)胞受到氧化損傷。現(xiàn)在,普遍認(rèn)為在神經(jīng)退行性疾病和心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中氧化應(yīng)激起重要作用,但是其中的分子機(jī)制仍不是很清楚。KLF9在大腦和肝臟中的表達(dá)相對(duì)較高,但是其在反應(yīng)活性氧方面方面的作用機(jī)制仍然不清楚。過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ激活因子1α （PGC-1α）能共激活多種轉(zhuǎn)錄因子,如ERRα和PARγ,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。為了研究KLF9調(diào)節(jié)小鼠原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因表達(dá)的分子機(jī)制,本課題利用過(guò)表達(dá)和敲低KLF9的腺病毒Ad-KLF9、Ad-shKLF9感染野生型小鼠原代肝臟細(xì)胞,并在野生型小鼠和KLF9KO小鼠原代肝臟細(xì)胞中通過(guò)PGC-1α的拯救實(shí)驗(yàn),用real time PCR和western blot檢測(cè)抗ROS基因（CAT,SOD2,和GPx1）的表達(dá)。H202可以刺激野生型小鼠原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá),該刺激作用在KLF9KO小鼠肝臟細(xì)胞中明顯降低。雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明KLF9可以激活PGC-1α基因的啟動(dòng)子。在野生型小鼠的原代肝臟細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF9,抗ROS基因的表達(dá)水平明顯上調(diào),敲低KLF9的內(nèi)源性表達(dá),... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
材料與方法
1. 實(shí)驗(yàn)材料
    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 菌株和細(xì)胞系
        1.2.1 細(xì)菌菌株
        1.2.2 細(xì)胞系
    1.3 質(zhì)粒載體
    1.4 工具酶以及分子量標(biāo)準(zhǔn)
    1.5 試劑盒
    1.6 化學(xué)試劑（按試劑公司分類(lèi)）
    1.7 主要儀器及設(shè)備
    1.8 分析軟件
    1.9 實(shí)驗(yàn)所用引物
2. 實(shí)驗(yàn)方法
    2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        2.1.1 PCR法擴(kuò)增目的片段
        2.1.2 PCR點(diǎn)突變KLF9在PGC-1α基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)
        2.1.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳
        2.1.4 DNA凝膠回收（Axygen試劑盒）
        2.1.5 DNA及載體的酶切
        2.1.6 片段與載體的連接
        2.1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.1.8 陽(yáng)性克隆的篩選
        2.1.9 質(zhì)粒DNA的大量制備
    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件
        2.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇
        2.2.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.2.4 細(xì)胞的凍存
        2.2.5 細(xì)胞的計(jì)數(shù)
    2.3 細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
    2.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定啟動(dòng)子活性
    2.5 總RNA提取及cDNA合成
        2.5.1 總RNA的提取
        2.5.2 總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
    2.6 Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)
    2.7 細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離提取
        2.7.1 溶液配制
        2.7.2 蛋白樣品的制備
        2.7.3 BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的濃度
    2.8 Western blot
        2.8.1 試劑配制
        2.8.2 SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS—PAGE）
        2.8.3 轉(zhuǎn)膜
        2.8.4 封閉及雜交
        2.8.5 發(fā)光鑒定
    2.9 重組腺病毒的構(gòu)建與包裝
    2.10 小鼠肝原代細(xì)胞的分離以及培養(yǎng)
        2.10.1 實(shí)驗(yàn)物品
        2.10.2 溶液
        2.10.3 步驟
    2.11 統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)流程
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2O₂刺激小鼠的原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)">    1. H₂O₂刺激小鼠的原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)
    2. KLF9可以激活小鼠PGC-1α基因的啟動(dòng)子
    3. KLF9基因過(guò)表達(dá)腺病毒的包裝及原代肝細(xì)胞水平驗(yàn)證
    4. 過(guò)表達(dá)KLF9激活小鼠原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)
    5. 干擾KLF9減弱小鼠原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)
    6. KLF9通過(guò)PGC-1α來(lái)調(diào)節(jié)抗ROS基因的表達(dá)
討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Glutathione Peroxidase Revisited—Simulation of the Catalytic Cycle by Computer-Assisted Molecular Modelling[J]. K. -D. AUMANN; N. BEDORF; R. BRIGELIUS-FLOHED;D. SCHOMBURG; AND L. FLOHE(Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Germany; Deutsches Institut fur Ernahrungsforschung (DIfE) Arthur-Scheunert-Allee 114.  Biomedical and Environmental Sciences. 1997(Z1)



本文編號(hào)：3115274