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基于電泳和再測序芯片的腹瀉癥候群檢測方法的建立及初步應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2017-04-13 22:26

  本文關(guān)鍵詞:基于電泳和再測序芯片的腹瀉癥候群檢測方法的建立及初步應(yīng)用,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:背景: 感染性腹瀉一般是由于致瀉性病毒或者致瀉性細(xì)菌感染引起的,對于發(fā)展中國家來說,腹瀉是嚴(yán)重的健康問題。由于腹瀉的癥狀大致相同,僅根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征無法準(zhǔn)確的判斷出相應(yīng)的病原體。傳統(tǒng)的腹瀉病原體診斷方法包括電子顯微鏡法,培養(yǎng)法和酶聯(lián)免疫吸附法。然而這些傳統(tǒng)的方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,其靈敏度和特異性也都不夠好。目前已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)當(dāng)中,幾乎沒有在同一樣本中同時(shí)檢測腹瀉細(xì)菌和病毒相關(guān)研究,然而為了為了揭示病原體之間的協(xié)同作用以及混合感染的臨床相關(guān)性,同時(shí)檢測細(xì)菌和病毒是很必要的。目前是市面上已有了同時(shí)檢測腹瀉細(xì)菌和病毒的商業(yè)化試劑盒Lumiex GPP和Seegene Diarrhea ACE,然而其高昂的價(jià)格和復(fù)雜的設(shè)備要求限制了這些方法在中國的省,市級疾控中心的推廣應(yīng)用。因此,我們亟需建立一套特異性好,靈敏度高,高通量的檢測方案,一方面能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室常規(guī)大量的腹瀉樣本檢測需求,另一方面能夠檢測常規(guī)方法無法檢出的不明原因腹瀉樣本。 目的: 本研究建立了兩種腹瀉病原體檢測方法。第一種方法時(shí)是基于全自動(dòng)毛細(xì)管電泳或者瓊脂糖凝膠電泳的一步法兩管多重PCR方法,可以同時(shí)檢測13種常見的腹瀉病毒和腹瀉細(xì)菌;第二種方法是基于新型再測序芯片的腹瀉癥候群檢測方法,可以同時(shí)檢測14種輪狀病毒,7種杯狀病毒(包括諾如病毒和札如病毒),8種星狀病毒,28種腸道病毒和16種不常見的致瀉病毒。 方法: 對于兩管法PCR,病毒管(V管)可以同時(shí)檢測6種常見的腹瀉病毒,包括A組輪狀病毒(rotavirusA, RVA);諾如病毒(noroviruses, NoVs)的GⅠ型和GⅡ型;人類星狀病毒(human astrovirus, HAstV);腸道腺病毒(enteric adenoviruses, EAds)以及人類博卡病毒(human bocavirus, HBo V);細(xì)菌管(B管)可以同時(shí)檢測7中致瀉細(xì)菌,包括沙門氏菌(Salmonella),副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus),致瀉性大腸桿菌{diarrheogenic Escherichia coli),空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni),志賀氏菌(Shigella),耶爾森菌(Yersinia)和霍亂弧菌(Vibrio cholera)。在再測序芯片方法中,將所有特異性引物分成A、B、C、D、E和F六組分別放在6個(gè)反應(yīng)管內(nèi),每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)分別加入一對內(nèi)參基因的引物和一對相同的通用引物。兩管法和芯片法的特異性都由陽性的臨床樣本進(jìn)行檢測,而靈敏度則使用10倍梯度稀釋的體外轉(zhuǎn)錄RNA,重組質(zhì);蛘叨康木簛頊y定。通過調(diào)整腹瀉再測序芯片內(nèi)參的濃度,摸索了最為合理的陽性判定閾值,同時(shí)優(yōu)化了腸道病毒的檢測步驟。使用了122份腹瀉樣本對方法進(jìn)行臨床評估,首先用兩管一步法PCR對所有樣本進(jìn)行篩查,然后從其中的陰性樣本中隨機(jī)挑選出10份不明原因樣本使用再測序芯片方法進(jìn)行篩查。 結(jié)果: 兩管法和RPM法的對于病毒的靈敏度都能達(dá)到20-200拷貝,對細(xì)菌則能檢測到濃度為102-103CFU/mL。從臨床樣本的評估結(jié)果看來,兩管法與參考方法沒有顯著差異。而再測序芯片的臨床檢測靈敏度更高,從10份不明原因的腹瀉樣本中檢測出6例陽性樣本。 結(jié)論: 成功建立一步法兩管多重RT-PCR同時(shí)檢測13腹瀉病原體的快速、經(jīng)濟(jì)、高靈敏度、高特異性、高通量的新技術(shù),有助于提高我國對腹瀉病原體的常規(guī)監(jiān)測能力,增強(qiáng)對腹瀉傳染病暴發(fā)的應(yīng)急檢測能力;成功建立了基于RPM-IVDC的腹瀉癥候群檢測方法,再測序芯片的再測序和高通量優(yōu)勢在公共衛(wèi)生領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景,為提高我國應(yīng)對突發(fā)傳染病的能力和控制傳染病的流行有重要意義。
【關(guān)鍵詞】:腹瀉 病毒 細(xì)菌 Qiaxcel 再測序芯片
【學(xué)位授予單位】:中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號】:R574.62
【目錄】:
  • 中英文縮寫一覽表7-9
  • 中文摘要9-11
  • Abstract11-13
  • 前言13-21
  • 第一部分 基于電泳的兩管一步法多重PCR技術(shù)的建立及初步應(yīng)用21-39
  • 1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
  • 1.1 陽性參考樣本22-23
  • 1.2 臨床樣本23-24
  • 1.3 所用試劑24
  • 1.4 軟件24
  • 1.5 所用儀器及耗材24
  • 2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
  • 2.1 引物24-26
  • 2.2 標(biāo)本采集與核酸提取26
  • 2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備26-27
  • 2.4 多重檢測體系的建立27-29
  • 2.5 多重檢測體系的特異性29-30
  • 2.6 多重檢測體系的靈敏度30
  • 2.7 臨床樣本檢測30
  • 2.8 數(shù)據(jù)分析30
  • 3 結(jié)果30-34
  • 3.1 特異性30-32
  • 3.2 靈敏度32
  • 3.3 臨床樣品檢測結(jié)果32-34
  • 4 討論34-39
  • 第二部分 基于再測序芯片的腹瀉癥候群將檢測技術(shù)的建立及初步應(yīng)用39-56
  • 1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
  • 1.1 陽性參考樣本40
  • 1.2 臨床樣本40
  • 1.3 試劑40-41
  • 1.4 軟件41
  • 1.5 儀器與耗材41
  • 2 實(shí)驗(yàn)方法41-50
  • 2.1 引物41-48
  • 2.2 標(biāo)本采集與核酸提取48
  • 2.4 多重檢測體系的建立48-50
  • 2.5 RPM的特異性50
  • 2.6 RPM的靈敏度50
  • 2.7 臨床樣本檢測50
  • 3 結(jié)果50-52
  • 3.1 特異性50-51
  • 3.2 靈敏度51
  • 3.3 不明原因樣本檢測結(jié)果51-52
  • 4 討論52-56
  • 全文總結(jié)56-57
  • 創(chuàng)新性57-58
  • 參考文獻(xiàn)58-65
  • 附錄 RPM-IVDC4-2檢測腹瀉癥候群SOP65-71
  • 綜述 基因芯片在病原體檢測方面的應(yīng)用71-79
  • 參考文獻(xiàn)76-79
  • 致謝79-80
  • 攻讀碩士研究生期間完成的論文80-82
  • 個(gè)人簡歷82

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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  本文關(guān)鍵詞:基于電泳和再測序芯片的腹瀉癥候群檢測方法的建立及初步應(yīng)用,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。



本文編號:304638

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