本文關鍵詞：肝星狀細胞自噬現象的特征鑒定及其生物學意義的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：在確認肝星狀細胞存在自噬現象的基礎上，通過體外調節(jié)肝星狀細胞的自噬水平，，觀察自噬水平改變對此細胞增殖及前膠原表達的影響，探討以自噬信號通路為靶點治療肝纖維化的可行性，為抗肝纖維化治療提供新的理論依據。 方法：1.梯度密度法分離、原代培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞（HSC），光鏡觀察細胞生長情況;2.通過透射電鏡觀察大鼠HSC發(fā)生自噬時的超微形態(tài)學特征；3. MDC染色法結合熒光顯微技術觀察HSC中的自噬溶酶體的形態(tài)改變；4.Western-blot技術檢測HSC中自噬信號分子蛋白的表達；5.Real-time PCR技術檢測HSC中Ⅰ型前膠原mRNA的表達；6.通過CellTiter96Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTT)方法分析HSC的增殖情況；7.通過流式細胞術檢測HSC的細胞凋亡率。8.通過自噬信號促進劑、抑制劑的應用，觀察HSC自噬水平的應答變化，分析與HSC增殖、膠原生成等靶效應間的關系。 結果：本研究通過梯度密度法成功分離和原代培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞，在此基礎上，1.觀察到熒光顯微鏡及掃描超微電鏡下的HSC自噬表現特征；檢測到HSC中存在自噬信號通路相關分子的表達。2.與對照相比，用EBSS培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)法，可誘導出HSC中自噬體數量明顯增加。用自噬促進劑Rapamycin孵育HSC可刺激細胞自噬通路分子ATG5、beclin1、LC3II的表達升高；而自噬抑制劑3MA顯著下調HSC中這些自噬分子的表達。3. Real-time PCR檢測顯示，自噬抑制劑3MA減少HSC中Ⅰ型前膠原mRNA的表達；相反，自噬促進劑Rapamycin使HSC中Ⅰ型前膠原mRNA的表達升高。此外，MTT分析顯示，自噬抑制劑3MA抑制肝星狀細胞的增殖，呈濃度依賴性。4.用重組人TGFβ1明顯刺激HSCⅠ型前膠原mRNA轉錄增加；再加入Rapamycin后，發(fā)現可進一步上調細胞Ⅰ型前膠原mRNA水平；TGFβ1誘導的Ⅰ型前膠原mRNA增量可被3MA作用所逆轉。5.使用羥基氯喹HCQ刺激，發(fā)現明顯增加細胞自噬分子蛋白質LC3B及自噬溶酶體的表達。與此同時，HCQ發(fā)現可濃度依賴性降低HSC-T6中Ⅰ型前膠原mRNA的表達并濃度依賴性抑制HSC-T6增殖。有趣的是，HCQ作用下HSCⅠ型前膠原mRNA的表達水平與細胞的增殖抑制率呈負相關關系，P=0.02，相關系數r=-0.882。6.用Western blot檢測不同階段的肝纖維化大鼠模型肝臟組織，發(fā)現隨著四氯化碳注射誘導時間的延長，肝組織中Atg5、beclin-1的表達上升。7.同時將HCQ、3MA與HSC共孵育24h后，發(fā)現聯合用藥比單藥的致細胞調亡率更明顯，P＜0.05。 結論：1.本研究確認肝星狀細胞存在自噬現象；2.自噬水平的調節(jié)可影響肝星狀細胞的增殖及前膠原mRNA的表達，抑制自噬可抑制HSC的增殖及前膠原mRNA的表達，提示自噬信號通路為治療肝纖維化的新靶點；3.羥氯喹明顯抑制自噬信號傳遞，同時顯示出顯著減少HSCⅠ型前膠原mRNA表達的作用，提示其在抗肝纖維化治療方面的誘人前景。
【關鍵詞】：肝星狀細胞 自噬 自噬溶酶體 肝纖維化 羥氯喹 前膠原mRNA
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 主要中英文縮略語表4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-14
• 方法與材料14-29
• 結果29-48
• 討論48-55
• 結論55-56
• 參考文獻56-60
• 綜述：自噬與肝臟疾病60-74
• 參考文獻67-74
• 致謝74

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本文編號：303750