發(fā)布時間：2020-12-31 13:59

　　目的構(gòu)建靶向COX2-shRNA慢病毒載體,觀察COX-2shRNA對肝星狀細胞衰老的影響,探討其對肝纖維化的抑制作用及機制。方法1.構(gòu)建3條COX-2shRNA序列至慢病毒載體GV248中,感染大鼠HSC-T6細胞株,通過實時熒光定量PCR技術(shù)篩選出干擾效率最高的COX-2shRNA序列。2.將干擾效率最高的COX-2shRNA慢病毒載體,通過尾靜脈注射到高脂-CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠中。12周末,處死大鼠。油紅“O”染色（冰凍切片）、HE染色和Masson染色分析肝組織脂肪變性及纖維病變程度;β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老;實時熒光定量PCR檢測肝組織勻漿COX-2mRNA、α-SMAmRNA、p53mRNA的表達。同時檢測血清總膽固醇、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量。3.以大鼠HSC-T6細胞株為研究對象,應(yīng)用PFT-α抑制p53活性來研究p53通路在COX-2shRNA誘導(dǎo)HSC-T6衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老,CCK8檢測細胞增殖,流式細胞儀測定細胞周期,q-PCR檢測p53mRNA及p21mRNA的表達。結(jié)果1.通過qPCR對3條序列慢病毒干擾... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１?ＲＮＡｉ慢病毒載體構(gòu)建實驗流程??Ｆｉｇ．?１－１?ＲＮＡｉ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ??．

針對大鼠Ｃ０Ｘ－２基因ｓｈＲＮＡ慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）栽體的構(gòu)建及鑒定??心ｌｍｉｎ，棄下層廢液；??６００）ｉｌ預(yù)先配置好的漂洗液，１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄下層廢０００?ｒｐｍ空離２?ｍｉｎ，進一步除去殘留的漂洗液；??凈臺中將回收柱轉(zhuǎn)移至新的１．５?ｍｌ?ＥＰ管中，靜置１０？２０?ｍｉｎ，收柱中加入９５?｜ｉｌ?Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ?Ｗａｔｅｒ，靜置２?ｍｉｎ，１２０００?ｒｐｍ品做好編號，電泳、測定濃度，進行質(zhì)檢。??與質(zhì)量檢測??

１）測定前一天，使用２９３Ｔ貼壁細胞鋪板，９６孔板，每孔４ｘｌ〇個細胞，體積??００?＾１；??２）根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準備７？１０個無菌的ＥＰ管，每管中加入９０?０無血清??養(yǎng)基；??３）取待測定的病毒原液１０＃加入到第一個管中，混勻后，�。保�?ＩＩ伽入到第??個管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管；??４）選取所需的細胞孔，棄去９０?４培養(yǎng)基，加入９０?０稀釋好的病毒溶液，培??箱培養(yǎng)；５）２４?ｈ后，加入完全培養(yǎng)基１００?４，小心操作，不要吹起細胞；??６）?４天后，觀察熒光表達情況，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。??Ｂ藥篩法測定滴度??１－５步驟與“突光法測定滴度”相同，感染后７２?ｈ加入抗性藥物ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，??持藥物濃度５卩ｇ／ｍｌ。繼續(xù)培養(yǎng)１天，觀察細胞生長狀況。??病毒樣品稀釋說明：??

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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本文編號：2949731