目的構(gòu)建靶向COX2-shRNA慢病毒載體,觀察COX-2shRNA對(duì)肝星狀細(xì)胞衰老的影響,探討其對(duì)肝纖維化的抑制作用及機(jī)制。方法1.構(gòu)建3條COX-2shRNA序列至慢病毒載體GV248中,感染大鼠HSC-T6細(xì)胞株,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩選出干擾效率最高的COX-2shRNA序列。2.將干擾效率最高的COX-2shRNA慢病毒載體,通過(guò)尾靜脈注射到高脂-CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠中。12周末,處死大鼠。油紅“O”染色（冰凍切片）、HE染色和Masson染色分析肝組織脂肪變性及纖維病變程度;β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織勻漿COX-2mRNA、α-SMAmRNA、p53mRNA的表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)血清總膽固醇、甘油三酯、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量。3.以大鼠HSC-T6細(xì)胞株為研究對(duì)象,應(yīng)用PFT-α抑制p53活性來(lái)研究p53通路在COX-2shRNA誘導(dǎo)HSC-T6衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老,CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期,q-PCR檢測(cè)p53mRNA及p21mRNA的表達(dá)。結(jié)果1.通過(guò)qPCR對(duì)3條序列慢病毒干擾... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：113 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１?ＲＮＡｉ慢病毒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)流程??Ｆｉｇ．?１－１?ＲＮＡｉ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ??．

針對(duì)大鼠Ｃ０Ｘ－２基因ｓｈＲＮＡ慢病毒（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）栽體的構(gòu)建及鑒定??心ｌｍｉｎ，棄下層廢液；??６００）ｉｌ預(yù)先配置好的漂洗液，１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄下層廢０００?ｒｐｍ空離２?ｍｉｎ，進(jìn)一步除去殘留的漂洗液；??凈臺(tái)中將回收柱轉(zhuǎn)移至新的１．５?ｍｌ?ＥＰ管中，靜置１０？２０?ｍｉｎ，收柱中加入９５?｜ｉｌ?Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ?Ｗａｔｅｒ，靜置２?ｍｉｎ，１２０００?ｒｐｍ品做好編號(hào)，電泳、測(cè)定濃度，進(jìn)行質(zhì)檢。??與質(zhì)量檢測(cè)??

１）測(cè)定前一天，使用２９３Ｔ貼壁細(xì)胞鋪板，９６孔板，每孔４ｘｌ〇個(gè)細(xì)胞，體積??００?＾１；??２）根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備７？１０個(gè)無(wú)菌的ＥＰ管，每管中加入９０?０無(wú)血清??養(yǎng)基；??３）取待測(cè)定的病毒原液１０＃加入到第一個(gè)管中，混勻后，�。保�?ＩＩ伽入到第??個(gè)管中，繼續(xù)相同的操作直到最后一管；??４）選取所需的細(xì)胞孔，棄去９０?４培養(yǎng)基，加入９０?０稀釋好的病毒溶液，培??箱培養(yǎng)；５）２４?ｈ后，加入完全培養(yǎng)基１００?４，小心操作，不要吹起細(xì)胞；??６）?４天后，觀察熒光表達(dá)情況，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。??Ｂ藥篩法測(cè)定滴度??１－５步驟與“突光法測(cè)定滴度”相同，感染后７２?ｈ加入抗性藥物ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，??持藥物濃度５卩ｇ／ｍｌ。繼續(xù)培養(yǎng)１天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。??病毒樣品稀釋說(shuō)明：??

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：2949731