丙型肝炎病毒（HCV）在全世界約有1.7億感染者，由于其疫苗難以研制且尚無特效藥，因此，對丙型肝炎的早期診斷是非常有意義的。現(xiàn)階段對丙肝的常規(guī)診斷方法為PCR與ELISA，二者雖屬于成熟的檢測方式，但均較為耗時，操作繁瑣，HCV的檢測急需簡便且靈敏的方法。本文利用分子信標(biāo)與金納米顆粒針對HCV病毒RNA做了一系列檢測及基因分型的實驗。首先是使用Duplex-specific nuclease（DSN）作為分子信標(biāo)的信號放大工具，針對HCV RNA做了直接檢測。同時，還有利用該探針對HCV RNA的PCR產(chǎn)物進行檢測達(dá)到基因分型目的的實驗。另外，應(yīng)用金納米顆粒，我們對HCVRNA做了靈敏而簡易的檢測。（1）通過DSN對MB與RNA的雜交產(chǎn)物進行酶切，可實現(xiàn)RNA的重復(fù)利用，雜交信號得到了放大。DSN能將MB的檢測靈敏度提高2000倍以上。對于JFH1RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，我們在較低的濃度下將其檢測了出來。然后，實驗檢測了huh7.5陽性細(xì)胞的RNA。對于血清RNA樣品，此體系也能區(qū)分其陰性與陽性，且信號強弱與ELISA結(jié)果一致。（2）利用MB對PCR產(chǎn)物進行檢測，即可知道模板除開引物外，其他位... 

【文章來源】：湖南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
第1章 緒論
    1.1 丙型肝炎的現(xiàn)狀
    1.2 丙型肝炎的常規(guī)檢測方式
        1.2.1 實時熒光定量 PCR
        1.2.2 酶聯(lián)免疫法
    1.3 分子信標(biāo)的性質(zhì)及其應(yīng)用
        1.3.1 分子信標(biāo)的基本原理與特點
        1.3.2 一些非常規(guī)的分子信標(biāo)介紹
        1.3.3 分子信標(biāo)的應(yīng)用
        1.3.4 一些放大分子信標(biāo)信號的方法
        1.3.5 本文關(guān)于 MB 檢測 HCV 的設(shè)想
    1.4 金納米顆粒的性質(zhì)及其應(yīng)用
        1.4.1 金納米顆粒的性質(zhì)與特點
        1.4.2 金納米顆粒在生物及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用
        1.4.3 利用金納米顆粒針對 HCV RNA 的簡單檢測方法
        1.4.4 本文擬采用金顆粒檢測 JFH1 RNA 的實驗
第2章 分子信標(biāo)與 DSN 對 HCV RNA 的超靈敏檢測
    2.1 前言
    2.2 實驗試劑與儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 JFH1 RNA 的體外轉(zhuǎn)錄
        2.3.2 JFH1 標(biāo)準(zhǔn) RNA 與分子信標(biāo)的雜交
        2.3.3 huh7.5 細(xì)胞系的培養(yǎng)、感染以及 RNA 提取
        2.3.4 血清 RNA 的提取
        2.3.5 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳
        2.3.6 小片段靶點 RNA 與分子信標(biāo)的雜交
        2.3.7 血清樣品的 ELISA 檢測
        2.3.8 在 DSN 的輔助下以分子信標(biāo)檢測 RNA
        2.3.9 細(xì)胞 RNA 的樣品的 PCR 檢測
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 分子信標(biāo)與 JFH1 RNA 的雜交反應(yīng)
        2.4.2 DSN 對分子信標(biāo)信號放大的可行性探究
        2.4.3 DSN 與分子信標(biāo)檢測 RNA 時的條件優(yōu)化
        2.4.4 DSN 對分子信標(biāo)檢測 RNA 放大效率的檢測
        2.4.5 DSN 與分子信標(biāo)對 JFH1 RNA 在較低濃度的檢測
        2.4.6 DSN 與分子信標(biāo)對 huh7.5 陽性細(xì)胞中 HCV RNA 的檢測
        2.4.7 DSN 與分子信標(biāo)對血清樣品中 HCV RNA 的檢測
    2.5 本章小結(jié)
第3章 利用分子信標(biāo)針對 HCV 的基因分型
    3.1 引言
    3.2 實驗試劑及儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 逆轉(zhuǎn)錄與普通 PCR
        3.3.2 瓊脂糖凝膠電泳
        3.3.3 分子信標(biāo)與 PCR 產(chǎn)物的雜交反應(yīng)
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 分子信標(biāo)與 PCR 產(chǎn)物雜交的可行性探究
        3.4.2 分子信標(biāo)與 PCR 產(chǎn)物雜交的條件優(yōu)化
        3.4.3 分子信標(biāo)分別檢測 H77S 與 JFH1 PCR 產(chǎn)物
    3.5 本章小結(jié)
第4章 利用金納米顆粒對 JFH1 RNA 的直接檢測
    4.1 引言
    4.2 實驗試劑與儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 金納米顆粒檢測體系的建立
        4.3.2 在此檢測體系中 JFH1 RNA 與引物的雜交
        4.3.3 反應(yīng)結(jié)束后金顆粒體系的吸光度測定
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 金納米顆粒檢測 JFH1 RNA 的可行性研究
        4.4.2 金納米顆粒檢測 JFH1 RNA 實驗的條件優(yōu)化
        4.4.3 金納米顆粒對 JFH1 RNA 的檢測
        4.4.4 在復(fù)雜體系中金納米顆粒對 JFH1 RNA 的檢測
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻
附錄 攻讀學(xué)位期間參與項目及發(fā)表論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2938217