【目的】:制備雙砷染料標(biāo)記的熒光乙型肝炎病毒（hepatits B virus,HBV）體,對(duì)其形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定分析,并動(dòng)態(tài)觀察HBV熒光體在活細(xì)胞中的生物學(xué)行為。【方法】:采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將已成功構(gòu)建帶有TC標(biāo)簽的1.3倍乙型肝炎病毒基因組的載體質(zhì)粒（pTHBV1.3-mTC1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株中,該重組載體是通過(guò)PCR定點(diǎn)基因突變技術(shù)將一個(gè)能與雙砷熒光染料特異性結(jié)合的TC標(biāo)簽（C-C-P-G-C-C）在基因水平上插入到HBV核心蛋白免疫主區(qū)c/el位點(diǎn)。48h后通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)表面抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與分布;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）的表達(dá);同時(shí)收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液,經(jīng)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行分離和純化后,加抗體孵育進(jìn)行免疫電鏡觀察分析,同等培養(yǎng)條件下HepG2細(xì)胞和2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照�；罴�(xì)胞研究中,我們應(yīng)用Oregon Green ? 488 Taxol標(biāo)記微管骨架后,在活細(xì)胞時(shí)差共聚焦顯微鏡下觀察熒光HBV病毒體在宿主細(xì)胞中的運(yùn)輸過(guò)程�！窘Y(jié)果】:間接免疫熒光結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染pTHBV1.3... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

擴(kuò)增后兩種質(zhì)粒DNA的電泳鑒定

本部分圖片：1 M 210000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bp圖 1：擴(kuò)增后兩種質(zhì)粒 DNA 的電泳鑒定: MarkerDL10000；1：突變質(zhì)粒 pTHBV1.3-mTC1，共三個(gè)復(fù)孔；2：野生THBV1.3，共三個(gè)復(fù)孔

圖 3：表面抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及與雙砷染料的共定位分別用相差顯微鏡和共聚焦顯微鏡拍攝，1：轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒 pTHBV1.3 組；2：轉(zhuǎn)突變質(zhì)粒 pTHBV1.3-mTC1 組；3：未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。DAPI(細(xì)胞核染料，藍(lán)色抗表面抗原抗體（綠色），ReAsH（雙砷染料，紅色）。（標(biāo)尺：50μm）圖 4：共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染 48h 后培養(yǎng)上清懸液中雙砷標(biāo)記結(jié)果左圖為轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒 pTHBV1.3 組培養(yǎng)上清液；右圖為轉(zhuǎn)染 pTHBV1.3-mTC培養(yǎng)上清液。兩者顯示明顯的熒光強(qiáng)度差異，顯示此熒光為特異性標(biāo)記。（b50μm）


本文編號(hào)：2919206