乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。HBV感染可導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。HBV屬于嗜肝DNA病毒,具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行復(fù)制。HBV編碼的DNA聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶(DNA polymerase/Reverse transcriptase,DNA pol/RT)的結(jié)構(gòu)和功能在其復(fù)制過程中起重要作用。1976年,α-干擾素(Interferon-α,IFN-α)被成功用于治療慢性乙型肝炎,它通過建立細(xì)胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約2/3的患者對IFN-α治療無反應(yīng),這與HBV DNA聚合酶有關(guān)。Foster等發(fā)現(xiàn),HBV DNA聚合酶的末端蛋白(TP)可顯著抑制細(xì)胞對IFN-α反應(yīng),并認(rèn)為是由TP表達(dá)阻斷IFN-α通路引起。本實驗室先前通過構(gòu)建一系列基因缺失突變體方式,發(fā)現(xiàn)HBV DNA聚合酶末端蛋白+Spacer區(qū)(部分或全部)具有抗IFN-α作用,其中末端蛋白+部分Spacer區(qū)共計257個氨基酸(TP257)抗IFN-α作用尤為明顯,但其機制尚不清楚。本研究擬應(yīng)用AdEasy XL Adenoviral Vector System表達(dá)TP257蛋白并通過免疫沉淀篩選與相互作用的細(xì)胞蛋白,初步探討HBV DNA聚合酶TP區(qū)IFN-α作用機制,為研制新的抗HBV藥物提供新的思路。 為包裝重組腺病毒AD-TP257,并在Huh7細(xì)胞中獲得表達(dá),首先構(gòu)建穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并重組到腺病毒骨架載體pADEasy-1,通過293A細(xì)胞包裝重組腺病毒,感染人肝癌細(xì)胞Huh7,Western-blot驗證TP257蛋白表達(dá);為篩選與TP257抗干擾素效應(yīng)相關(guān)細(xì)胞蛋白,分別在重組腺病毒感染細(xì)胞前或感染細(xì)胞后加入IFN-α,收獲細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫沉淀,通過質(zhì)譜鑒定差異蛋白。實驗結(jié)果表明重組腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7細(xì)胞并大量表達(dá)TP257蛋白;重組腺病毒AD-TP257感染細(xì)胞后加入IFN-α并通過免疫沉淀篩選到三種候選差異蛋白,經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為:熱休克蛋白60、組蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白調(diào)節(jié)輕鏈12A。因此,TP257可能通過上述蛋白影響病毒的抗干擾素效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

材料和方法料來源、質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 編碼 HBV DNA 聚合酶末端蛋白+部分 Spacer 257 個氨基酸 (TP257) 的重組質(zhì)粒 pNTAPB-TP257 由本實驗室構(gòu)建和空載體重組腺病毒 AD-GFP 由本實驗室包裝和保存；AdEasy XLiral Vector System 購自 Stratagene 公司，包括 pShuttle-IRES-hrGFP-1pADEasy-1 、BJ5183-Ad-1 和 XL-10 gold 菌株；大腸桿菌 DH5α 由本保存；Huh7 細(xì)胞購自 ATCC，293A 購自 Invitrogen 公司。

丙烯酰胺、SDS 、甘氨酸和三羥甲基胺基甲烷 (Tris) 等化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純；PVDF 膜購自 Amersham 公司， Cocktail 蛋白酶抑制劑和 CDP-Star 購自Roche 公司；RIPA 蛋白裂解液及 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購自碧云天公司；Monoclonal ANTI-FLAG M2 Antibody 購自 Sigma 公司，帶 AP 標(biāo)簽的羊抗鼠二抗體購自 Santa Cruz 公司；引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。2.實驗方法2.1 構(gòu)建重組腺病毒流程 (圖 2)

2.2.1 pShuttle-IRES-hrGFP-TP257 載體的構(gòu)建：(1) PCR 擴增 TP257 全長：以質(zhì)粒 pNTAPB-TP257 為模板，使用 Platinum TaqDNA Polymerase ， 進(jìn) 行 TP257 基 因 片 段 ( 圖 3) ， 所 用 引 物 序 列 為TP257shuIRESF-2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGCCCCTATCTTATCAA-3' ( 下劃線為 Not I 位點，方框內(nèi)為 Kozak 序列 ) ， TP257shuIRESR ： 5'ACGCGTCGACCCACCCCAAAAGACCGCCGTGT -3' (下劃線為Sal I位點) ，引物由上海博尚公司合成。擴增采用熱啟動方式，即：反應(yīng)先經(jīng) 95 °C 預(yù)變性5min，待溫度上升至 80 °C 后加入聚合酶，隨后進(jìn)入循環(huán)。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王林;柏世玉;陳婉南;李暉;林建銀;林旭;;乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干擾素功能區(qū)域分析[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2007年06期

本文編號：2890072