肝臟是體內(nèi)最大的生物代謝器官，也是外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物攻擊的主要靶器官。機體短期接觸較大劑量外源性物質(zhì)可引起急性肝損傷，在外來因素長期作用下，如果不能完全修復(fù)，可發(fā)展成慢性肝損傷。肝纖維化是各種慢性肝損傷的共有病理變化，其持續(xù)發(fā)展為肝硬化可引起肝功能衰竭甚至肝細胞癌，已成為一個危害人類生命健康的世界性問題。但目前急慢性肝損傷作用的發(fā)病機制尚未完全闡明，仍未發(fā)現(xiàn)十分確定、特效的藥物，因此，深入研究急慢性肝損傷的發(fā)病機制，為臨床尋找理想的抗肝損傷藥物，尤其是抗纖維化的藥物，具有重要的理論和臨床意義。 最近研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ER Stress）在許多肝臟疾病中發(fā)揮了重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是廣泛存在于真核細胞中的一種重要的細胞器，負責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝和運輸?shù)�。在外來因素刺激作用下，細胞處于�?yīng)激狀態(tài)，引起未折疊蛋白反應(yīng)，它本是機體的一種自我保護機制，但當(dāng)應(yīng)激持續(xù)發(fā)生時，則會激活脂肪生成、炎癥和凋亡等途徑，引發(fā)一系列的病理性反應(yīng)。最近的一些研究也顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急慢性肝損傷形成過程中發(fā)揮了一定在作用，與肝纖維化的形成密切相關(guān)。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與急慢性肝損傷，尤其是肝纖維化的確切機制尚未完全闡明。 四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl_4）誘導(dǎo)的急慢性肝損傷模型是研究肝損傷機制的經(jīng)典模型之一。本研究首先觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在CCl_4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中的變化，在此基礎(chǔ)上進一步研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝纖維化中的作用及部分機制，主要內(nèi)容概括如下： 1ER stress在CCl_4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中的作用 1.1CCl_4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷 為探討ER stress在小鼠急性肝損傷中的作用，本研究在經(jīng)腹腔單次注射CCl_4（0.3ml/kg BW）后不同時點（0,2,6,12,24和72h）分別剖殺小鼠，稱量體重和肝臟質(zhì)量，留取血液和肝臟組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，CCl_4在處理后12h小鼠肝重與肝指數(shù)明顯增加，以72h最顯著；CCl_4處理后2h即引起ALT明顯升高，24h達最高峰，升高約千倍，72h接近對照組正常值。病理組織學(xué)檢查顯示CCl_4處理6h后，引起明顯的氣球樣變和點狀壞死；12h進展為塊狀壞死；至24h壞死最顯著，肝細胞呈大片壞死；72h壞死區(qū)域有大量的炎性細胞浸潤。 1.2CCl_4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝臟ER Stress效應(yīng) 為觀察急性肝損傷小鼠肝臟ER Stress效應(yīng)，采用免疫組化技術(shù)檢測急性肝損傷小鼠肝臟GRP78分布的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，在CCl_4處理后2h，在少量肝細胞中出現(xiàn)GRP78棕黃色特異性染色，6h肝細胞特異性染色呈明顯的帶狀分布，12h肝細胞出現(xiàn)區(qū)域性特異性染色，24h肝細胞特異性染色分布最廣且最深，72h肝細胞GRP78特異性染色明顯減弱。 采用Western blotting技術(shù)檢測GRP78蛋白表達以及下游IRE1α、eIF2α蛋白磷酸化水平和ATF6核蛋白水平的動態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，在CCl_4處理后6h肝臟組織GRP78顯著升高，在12h達到高峰，并持續(xù)至24h，在72h恢復(fù)至正常對照水平；在CCl_4處理后2h，肝臟組織IRE1α蛋白磷酸化水平顯著升高，至12h肝臟組織IRE1α蛋白磷酸化水平仍明顯升高；在CCl_4處理后12h，肝臟組織eIF2α蛋白磷酸化水平明顯升高，并持續(xù)至72h，以24h磷酸化水平最顯著；在CCl_4處理后6h肝臟組織ATF6核蛋白水平顯著升高，在24h升高最為顯著，在72h恢復(fù)至正常對照水平。上述結(jié)果提示CCl_4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中發(fā)生ER Stress效應(yīng)。 1.3急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的動態(tài)變化 為觀察急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的動態(tài)變化，采用TUNEL技術(shù)進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，在CCl_4處理后2至12h，僅有少量肝臟細胞發(fā)生凋亡，在24h有大量區(qū)域性肝細胞發(fā)生凋亡，72h與正常對照組無明顯差異。上述結(jié)果提示CCl_4誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠在CCl_4處理后24h發(fā)生大量區(qū)域性肝細胞凋亡。 1.4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA對急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響 為進一步驗證CCl_4誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠發(fā)生肝細胞凋亡是否由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑PBA對急性肝損傷小鼠肝細胞凋亡的影響，在經(jīng)腹腔注射給予CCl_4（0.30ml/kg BW）前24h、12h和在CCl_4處理后12h分別經(jīng)腹腔注射給予150mg/kg PBA進行干預(yù)，在CCl_4處理后24h剖殺小鼠，采用TUNEL技術(shù)檢測肝細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，PBA可明顯抑制CCl_4誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。以上結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CCl_4誘導(dǎo)急性肝損傷中發(fā)揮了重要作用，可能與其介導(dǎo)的肝細胞凋亡有關(guān)。2CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化與ER stress效應(yīng) 2.1CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的建立 為建立CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，每周2次經(jīng)腹腔注射給予CCl_40.15ml/kg（按10%溶于橄欖油中），共持續(xù)8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組比較，CCl_4誘導(dǎo)的小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平和總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（Direct Bilirubin，DBIL）和總膽汁酸（total biliary acid，TBA）含量以及反應(yīng)肝纖維化程度的組織羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量均顯著增高；病理組織學(xué)結(jié)果HE染色提示模型組小鼠肝臟中重度壞死，在壞死組織周圍有大量的炎癥細胞浸潤，膠原染色提示肝組織有大量膠原沉積，并分割肝組織形成假小葉趨勢。以上結(jié)果提示CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型建立成功。 2.2CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝臟ER Stress效應(yīng) 為觀察CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中，是否存在ER Stress效應(yīng)，采用Westernblotting技術(shù)檢測ER stress效應(yīng)標志性蛋白GRP78蛋白表達以及下游IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化模型小鼠肝臟GRP78蛋白表達顯著上調(diào)， IRE1α、eIF2α磷酸化水平以及ATF6核蛋白水平顯著增加。以上結(jié)果提示CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型發(fā)生ER stress效應(yīng)。 3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA對CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響 為進一步探討ER stress在CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化形成過程中的作用，采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA進行干預(yù)，觀察ER stress效應(yīng)被抑制后，對CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響，PBA+CCl_4干預(yù)組，在每周2次經(jīng)腹腔注射給予0.15ml/kg CCl_4的同時，每天兩次經(jīng)腹腔注射給予150mg/kg PBA，共持續(xù)8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與肝纖維化模型組相比，PBA干預(yù)顯著降低小鼠肝重和肝指數(shù)，并明顯降低血清DBIL、TBA水平和肝組織Hyp含量；病理學(xué)組織結(jié)果，PBA干預(yù)明顯減輕肝臟組織炎癥細胞數(shù)量與肝臟壞死程度，改善肝組織結(jié)構(gòu)，減少膠原沉積。 α-SMA是肝星狀細胞激活的標志，采用免疫組化技術(shù)和Western blotting技術(shù)分析α-SMA蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組比較，PBA干預(yù)顯著降低小鼠肝臟α-SMA的蛋白表達。采用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測肝纖維化關(guān)鍵性細胞因子TGF-β1mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比較，PBA干預(yù)顯著降低TGF-β1mRNA水平。 采用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測肝臟膠原標志物Col1a1和Col1a2mRNA水平以及膠原降解相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中Mmp2和Mmp9mRNA、金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor ofmetallopeptidases，TIMPs）中Timp1和Timp2mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，肝纖維化模型組小鼠Col1a1、Col1a2、Mmp2、Mmp9、Timp1、Timp2mRNA水平顯著增加；與模型組相比，PBA干預(yù)顯著抑制Colla1、Colla2、Mmp2和Timp1mRNA水平。以上結(jié)果提示：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與增加小鼠肝臟膠原纖維表達有關(guān)。 為進一步驗證ER stress在CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化中的作用，采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑PBA進行干預(yù)，觀察對肝纖維化小鼠的ER stress效應(yīng)的影響，采用Western blotting技術(shù)檢測GRP78蛋白表達、IRE1α、eIF2α磷酸化水平和ATF6核蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，PBA干預(yù)明顯抑制CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟GRP78蛋白表達的上調(diào)作用，降低IRE1α、eIF2α磷酸化水及核蛋白ATF6水平。以上結(jié)果進一步提示PBA可以抑制CCl_4誘導(dǎo)的肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，進一步證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮了重要的作用。 4ER stress在CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中的作用機制 4.1ER stress介導(dǎo)的NF-κB信號通路在CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中的作用 為進一步研究ER stress在CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中的作用機制，采用Western blotting和實時定量RT-PCR技術(shù)檢測CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑干預(yù)組對NF-κB信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化模型小鼠肝臟細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65核蛋白水平顯著增加；與模型組相比，PBA干預(yù)顯著降低細胞核內(nèi)NF-κB p65核蛋白水平。采用實時定量RT-PCR技術(shù)檢測NF-κB信號通路下游靶基因TNF-α mRNA水平，結(jié)果顯示：肝纖維化模型組小鼠肝臟TNF-α mRNA水平明顯增高；與模型組相比，PBA干預(yù)顯著降低TNF-α mRNA水平。以上結(jié)果提示ER stress在CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠中的作用機制，可能與其介導(dǎo)的NF-κB信號通路及炎癥反應(yīng)有關(guān)。 4.2ER stress介導(dǎo)的MAPKs信號通路在CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化中的作用 為進一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化作用中的機制，采用Western blotting技術(shù)檢測CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑干預(yù)組對MAPKs信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化模型組小鼠ERK和JNK磷酸化水平顯著增加，而p38的磷酸化水平明顯降低；與模型組相比，PBA干預(yù)顯著降低肝臟ERK和JNK的磷酸化水平，對肝臟磷酸化的p38的表達無明顯影響。以上結(jié)果提示ER stress在CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化形成過程中的作用機制，可能與其介導(dǎo)的ERK和JNK信號通路有關(guān)。 以上實驗結(jié)果綜合表明，ER stress在CCl_4誘導(dǎo)的急性肝損傷發(fā)揮了重要的作用，可能與其介導(dǎo)的肝細胞凋亡有關(guān)；ER stress在CCl_4誘導(dǎo)的慢性肝損傷——肝纖維化過程中也起了十分重要的作用，其作用機制可能與其介導(dǎo)的NF-κB信號通路和JNK、ERK信號通路有關(guān)。更為重要的是，ER stress效應(yīng)被抑制后，對肝纖維化具有一定保護作用，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可為開發(fā)防治肝纖維化疾病的藥物提供新的作用靶點和思路。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠血清 ALT 水平的變化Fig 1 Serum levels of ALT in CCl4induced acute liver injury miceere sacrificed at 0, 2, 6, 12, 24 and 72 hours after a single intraperitoneall4(0.30 ml/kg BW). The levels of ALT in serum from mice treated with oll or a single dose of CCl4after 2, 6, 12, 24 and 72 h were analyzed. All sed as means ± SEM (n = 6). **P<0.01, compared with the control.

4.1.1.3 急性肝損傷模型小鼠肝臟病理組織學(xué)的變化采用 HE 染色觀察 CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝臟病理的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常組小鼠肝臟無明顯異常（圖 2 A）；模型組小鼠在 CCl4處理后 6 h，肝細胞呈氣球樣變和點狀壞死（圖 2 C）；12 h 進展為塊狀壞死（圖 2 D）；至 24 h 肝細胞呈大片壞死，最顯著（圖 2 E）；72 h 壞死區(qū)域有大量的炎性細胞浸潤（圖 2 F）

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對照組小鼠肝細胞無特異性染色（圖3 A）；模型組小鼠在 CCl4處理后 2 h，在少量肝細胞中出現(xiàn) GRP78 棕黃色特異性染色（圖 3 B）；6 h 肝細胞特異性染色成明顯的帶狀分布（圖 3 C）；12 h 肝細胞出現(xiàn)區(qū)域性特異性染色（圖 3 D）；24 h 肝細胞特異性染色分布最廣且最深（圖 3 E）；72 h 肝細胞特異性染色明顯減弱（圖 3 F）。圖 3 急性肝損傷小鼠肝臟 GRP78 分布的動態(tài)變化（免疫組化，×100）A，正常對照組；B，CCl4處理后 2 h 組；C，6 h 組；D，12 h 組；E，24 h 組；F
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊明華;楊蘇蓓;柴可夫;金祖漢;陳婉姬;;四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模條件優(yōu)化及穩(wěn)定性考察[J];中藥藥理與臨床;2007年05期

2 范紅斌;李英;包菊平;邱麗穎;程建青;楊志勇;杜斌;;冰醋酸致小鼠實驗性腹膜炎模型的研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2007年06期

3 郭偉;李孟榮;肖建軍;黃敏;;塵螨過敏性哮喘小鼠模型的建立與評估[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2008年05期

4 杜曉棠;陳雪松;張美娟;季旻珺;吳觀陵;;p47 GTPase缺失對小鼠巨噬細胞成熟及功能的影響[J];中國病原生物學(xué)雜志;2009年04期

5 何冬梅;尤昭玲;賴毛華;劉慧萍;雷磊;盧芳國;;壽胎丸對反復(fù)自然流產(chǎn)小鼠母胎界面CD_4~+ T細胞STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2010年01期

6 朱小青;;逆轉(zhuǎn)EphB2的缺乏可以改善AD小鼠的認知功能[J];中國病理生理雜志;2011年04期

7 湯正好;王明麗;袁中玉;李京培;;人巨細胞病毒先天性感染胎鼠致肝臟損傷的小鼠模型[J];熱帶病與寄生蟲學(xué);1999年04期

8 楊牧祥;武常生;于文濤;胡金寬;;醒腦啟智膠囊對血管性癡呆小鼠腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶的影響[J];北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2006年03期

9 丁小燕;梁小玲;謝素貞;朱曉波;唐仕波;;氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型建立方法的改良[J];眼科學(xué)報;2006年02期

10 王志斌;姜普林;曾年華;李淑琴;王令春;李燕;熊仕秋;張兆山;;腸毒素大腸桿菌攻毒小鼠模型的建立以及疫苗候選株保護效果的評價[J];世界華人消化雜志;2006年28期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王建青;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急慢性肝損傷中的作用及部分機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

2 林寧;人參皂甙Rb1對高脂飲食誘導(dǎo)C57/BL6小鼠肥胖的預(yù)防作用及機制探討[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 趙剛;細胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的APOE缺陷小鼠腹主動脈瘤形成的影響及機制[D];華中科技大學(xué);2011年

4 王玨;具有“人源性微環(huán)境”的乳腺癌原位和轉(zhuǎn)移小鼠模型的建立和研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

5 盧潔;人MDS荷瘤小鼠模型的建立及砷劑、沙利度胺在荷瘤小鼠體內(nèi)抗瘤作用與機制的研究[D];浙江大學(xué);2005年

6 彭娟;白介素23調(diào)節(jié)過敏性氣道炎癥的機制研究[D];武漢大學(xué);2010年

7 劉海娜;巨噬細胞衍生趨化因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

8 馬芹穎;快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

9 段敏超;CD_4~+白細胞介素-17~+輔助性T細胞在香煙暴露肺氣腫小鼠中的作用機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

10 喻晶;IFN-γ對小鼠破骨細胞前體CXCR4表達的調(diào)節(jié)及意義[D];華中科技大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李兆圣;亞甲藍對APP/PS1小鼠海馬結(jié)構(gòu)Aβ及其相關(guān)蛋白表達的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2010年

2 林都;雙花顆粒對小鼠實驗性肝損傷的保護作用[D];西南大學(xué);2010年

3 王玲;表沒食子兒茶素沒食子酸酯對急性酒精中毒小鼠乙醇吸收的影響及其可能機制[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

4 儲昭新;植物乳桿菌對IL-10基因敲除結(jié)腸炎小鼠黏附分子的影響[D];蘇州大學(xué);2010年

5 侯娟;Th17/Treg失衡在EAE小鼠模型免疫學(xué)發(fā)病機制中的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

6 張靜;小鼠酒精性脂肪肝中線粒體生物合成的損傷[D];鄭州大學(xué);2010年

7 胡小丹;"Ala"~（16）-aFGF（1-29）對小鼠慢傳輸型便秘的治療作用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

8 謝春鳳;羊膜間充質(zhì)干細胞移植在抗衰老中的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

9 劉鵬飛;促紅細胞生成素受體抗體抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

10 龐麗;9.4T~1H-MRS定量檢測阿爾茨海默病小鼠海馬不同代謝物濃度的研究[D];汕頭大學(xué);2010年

本文編號：2889856