乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的臨床轉(zhuǎn)歸和對(duì)抗病毒治療的應(yīng)答,隨感染基因型的不同存在明顯差異。中國(guó)大陸地區(qū)主要以B型和C型為主,其中北方以C型多見,南方以B型多見。另外在我國(guó)一些地區(qū)還存在少量的基因型A和D。目前檢測(cè)HBV基因型的方法較多,但大都耗時(shí)費(fèi)力,價(jià)格昂貴。 目的:建立一種簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確檢測(cè)HBV基因型的方法,利用該方法實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)HBV A~D 4種基因型的檢測(cè),探討該方法用于臨床檢測(cè)HBV基因型的可行性。 方法:1.針對(duì)A、B、C和D型設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和型特異性探針。上游引物在5'端進(jìn)行地高辛修飾,探針兩端進(jìn)行多聚物加尾。選擇經(jīng)測(cè)序確定為HBV B型、C型的各1例慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本,提取病毒DNA,通過TA克隆獲得B、C型的標(biāo)準(zhǔn)株質(zhì)粒;根據(jù)NCBI收錄的HBV A、D、E~H型序列,將其分型探針和引物區(qū)域由公司合成,克隆在pMD18-T質(zhì)粒載體上,構(gòu)建A、D、E~H型的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒株。通過巢式PCR擴(kuò)增獲得用于雜交的目的片段。 2.設(shè)計(jì)一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn),對(duì)探針載體、探針濃度及修飾、探針在載體上的固定、雜交條件、洗脫條件、抗體濃度以及顯色方式進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳反應(yīng)條件,能特異靈敏的檢測(cè)HBV基因型。 3.利用構(gòu)建好的A~H型質(zhì)粒評(píng)價(jià)方法的特異性和靈敏性。將B、C型質(zhì)粒PCR產(chǎn)物按不同比例混合后雜交,評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)混合感染的能力。用該方法檢測(cè)70例臨床樣本的HBV基因型,同時(shí)對(duì)這批樣本的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序分型,比較兩種方法的一致性。 結(jié)果:1.成功構(gòu)建了A~H 8種基因型的重組質(zhì)粒株,選擇序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物和針對(duì)A~D型的分型探針。 2.優(yōu)化后最佳工藝反應(yīng)條件為:選擇帶正電荷尼龍膜為探針載體;探針進(jìn)行多聚dC加尾、濃度稀釋成10μmol/L,采用紫外交聯(lián)和高溫烘烤的方式對(duì)探針固定;地高辛抗體稀釋倍數(shù)1:10000;38℃雜交1h并在38℃用0.5×SSC/0.1%SDS嚴(yán)格洗脫15min;采用堿性磷酸酶催化NBT/BCIP的方式顯色。 3.該方法特異性好,沒有交叉反應(yīng)。靈敏度可檢測(cè)到拷貝數(shù)為103copy/ml或以上的樣本,并可檢測(cè)到含量為5%的混合型感染。對(duì)70例慢性乙型肝炎患者血清樣品的HBV基因型檢測(cè),其中67例樣本得以分型,另有3例樣本因?yàn)镻CR未能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶,用本方法和測(cè)序法均未能對(duì)其進(jìn)行分型。直接測(cè)序法與我們的方法檢測(cè)結(jié)果基本一致,特異性達(dá)98.51%。重慶地區(qū)感染HBV主要以B型為主。 結(jié)論:我們成功建立了一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)HBV基因型的方法。操作簡(jiǎn)單,適合臨床上大規(guī)模推廣使用,根據(jù)需要可以繼續(xù)設(shè)計(jì)其他型特異性探針,達(dá)到對(duì)8種基因型的檢測(cè),具有廣泛的應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

研究方案路線示意圖

圖 1-2：HBV 基因型探針和引物的保守性分析Fig1-2:The conservative analysis of HBV genotype probes and primersAs shown in the figure, P1,P2,P3 are fairly conserved among genotypes A~D.Probesone genotype are differ from the other genotypes.2.2 血清提取 HBV 病毒 DNA 的結(jié)果以 2 個(gè)病人血清提取 HBV 病毒 DNA 為模板進(jìn)行后期 PCR 反應(yīng)，得到相應(yīng)增產(chǎn)物，說明 HBV 病毒 DNA 提取成功。2.3 HBV B 型、C 型質(zhì)粒株的構(gòu)建結(jié)果2.3.1 PCR 擴(kuò)增 HBV B 型、C 型克隆片段以提取的病毒 DNA 為模板，擴(kuò)增 B、C 型的克隆片段，采用引物 P1、P4增，得到大小為 1000bp 左右的 PCR 產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小一致（見圖 1-3）。

圖 1-3：PCR 產(chǎn)物電泳圖譜Fig1-3: Electrophoresis of PCR produL2000; Lane 1: negative control ;Lane2:HLane 3:HBV C PCR Product質(zhì)粒的結(jié)果取的共 20 個(gè)克隆的菌液為模板，采電泳中觀察到大小為 1200bp 左右的原因，C 型的 10 個(gè)克隆的菌液 PCR 2 個(gè)陽(yáng)性克隆。C 型挑的 10 個(gè)克隆
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 唐文志;楊永強(qiáng);胡斌;黃小燕;譚星蓉;;廣東地區(qū)丙型肝炎患者幾種常見HCV基因型的快速檢測(cè)[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2008年05期

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本文編號(hào)：2885286