發(fā)布時間：2020-11-15 20:53

　　 肝臟疾病(如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精肝、肝纖維化及肝硬化等)嚴重危害人類健康。免疫性損傷是導致肝臟疾病的重要因素之一。ConA所致肝損傷模型由于其病理特征類似于人急性肝炎，被認為是研究人類病毒性肝炎和自身免疫性肝病的可靠模型。ConA與肝細胞膜有極強親和性，注入體內后大量聚集于肝臟，招募并激活多克隆T細胞，并促進其釋放多種細胞因子(如TNF-a和IFN-γ)，導致肝細胞損傷。 高遷移率族蛋白B1(high mobility group box，HMGB1)是一種核內蛋白，其分子含與DNA結合的2個結構域A-box和B-box，以及一個高度重復并富含酸性氨基酸的C-末端。HMGB1核內功能主要是使雙螺旋極度扭曲以便各種轉錄因子和染色質相互作用，并可調節(jié)類固醇激素受體、NF-κB、p53及RAG1／2重組酶的轉錄活性。 研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可由壞死細胞(而非凋亡細胞)被動釋放，或由受刺激的免疫細胞(包括單核／巨噬細胞、DC等)主動分泌至胞外。胞外HMGB1可通過其B盒與相應受體(RAGE、TLR2、TLR4)結合，從而發(fā)揮多種生物學效應：①直接介導非特異性炎癥反應(包括早期和晚期炎癥反應)；②作為一種警報素，激活DC，從而啟動、增強適應性免疫應答，參與炎癥性疾病如膿毒血癥、急性肺損傷、某些自身免疫病如(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎)、同種移植排斥反應及多種病理過程發(fā)生和發(fā)展。 國內有文獻報道，HMGB1參與D-GalN／LPS誘導的肝損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，注射Con A后1h，實驗動物體內HMGB1 mRNA表達即增加。但HMGB1參與Con A所致肝損傷的確切作用及其機制，國內外均尚未見文獻報道。 本課題建立Con A誘導的小鼠免疫性肝損傷模型，探討HMGB1參與免疫性肝損傷的作用及其機制；在此基礎上，制備抗HMGB1多克隆抗體和HMGB1特異性拮抗物HMGB1-A box重組蛋白，觀察其對免疫性肝損傷的保護作用，并初步探討其機制，為設計干預病毒性肝炎和自身免疫性肝炎的策略提供新思路。 一、HMGB1參與Con A所致急性肝損傷 尾靜脈注射建立Con A誘導的肝損傷模型，設立PBS對照組。 1．Con A注射后不同時間點HMGB1 mRNA表達 Con A注射后2 h、6 h、12 h、24 h取小鼠肝臟組織，提取總RNA，RT-PCR檢測HMGB1 mRNA表達水平。結果顯示：與對照組比較，Con A處理后2 h，HMGB1表達即上調，持續(xù)至24 h，尤以2 h為明顯。 2．肝組織HMGB1表達 Con A注射后12 h取小鼠肝臟，免疫組織化學分析肝組織HMGB1表達。結果發(fā)現(xiàn)：正常肝組織中，肝細胞和Kupffer細胞胞核內僅低表達HMGB1；急性肝損傷組Kupffer細胞和肝實質細胞胞核內HMGB1呈陽性表達，肝實質細胞壞死區(qū)內呈強陽性表達。 3．外源性HMGB1可加重Con A所致肝損傷 與單純Con A(10μg／g，i．t．)組比較，非致死劑量的重組HMGB1(20μg／mouse，i．t．)和相同劑量Con A同時注射，其ALT值明顯升高，而小劑量重組HMGB1(20μg／mouse)未引起小鼠ALT升高。 以上結果提示：HMGB1參與Con A誘導的急性肝損傷發(fā)生。 二、HMGB1特異性拮抗物的制備、純化和功能鑒定 1．重組HMGB1免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，并借助蛋白G柱純化。 2．用本室黃亞非博士構建的PGEX-4T-2-A box原核表達載體，原核表達獲得大量GST-A box融合蛋白；借助親和純化及去內毒素處理。 3．生物學實驗證實，抗HMGB1多克隆抗體和重組r-Abox可有效拮抗HMGB1的生物學功能。 三、HMGB1特異性拮抗物對Con A所致急性肝損傷的保護作用及機制 1．抗HMGB1多克隆抗體對肝損傷小鼠的影響 與IgG對照組比較，抗HMGB1多克隆抗體處理(0．6mg／mouse，30 min前給藥)能顯著降低Con A所致肝損傷，表現(xiàn)為：血清谷丙轉氨酶(ALT)明顯降低；HE染色顯示肝細胞水腫變性壞死和炎性浸潤均明顯較輕。 2．延遲給藥對小鼠血清ALT水平的影響 相同劑量Con A(15μg／g)注射2 h后，再給予抗HMGB1多克隆抗體(0．6mg／mouse)處理小鼠，檢測Con A注射12 h后小鼠血清ALT水平。結果發(fā)現(xiàn)：抗HMGB1多克隆抗體能明顯降低肝損傷小鼠血清ALT水平。 3．抗HMGB1多克隆抗體對肝損傷小鼠生存的影響 抗HMGB1抗體預處理小鼠，然后尾靜脈注射完全致死劑量Con A(25μg／g)，觀察抗HMGB1抗體對小鼠生存的影響。結果發(fā)現(xiàn)：與PBS與IgG組比較，抗HMGB1多克隆抗體處理不僅能提高小鼠生存率，并能延長小鼠存活時間。 4．r-A box對肝損傷小鼠血清ALT水平的影響 與對照組比較，r-Abox處理(0．6mg／mouse，30 min前給藥)能顯著降低Con A所致肝損傷小鼠血清ALT水平。 5．抗HMGB1抗體對炎性細胞因子(TNF-α、IFN-γ)水平的影響 Con A注射后，小鼠血清TNF-α、IFN-γ含量明顯增高；抗HMGB1抗體處理能顯著降低TNF-α、IFN-γ含量；體外實驗證實，抗HMGB1能抑制Con A誘導RAW264．7細胞分泌TNF-α的作用。 6．抗HMGB1抗體對NF-κB活性的影響 注射Con A 3 h后，提取肝組織細胞核蛋白，凝膠遷移率實驗(EMSA)檢測NF-κB活性。結果發(fā)現(xiàn)：急性肝損傷時，胞漿NF-κB被激活并向胞核內轉位。經抗HMGB1多克隆抗體預處理的小鼠，其肝組織細胞核內NF-κB活性水平顯著低于IgG對照組。 7．抗HMGB1抗體對肝細胞凋亡的影響 注射Con A 12 h后，切取肝組織，經4％多聚甲醛固定，制成石蠟切片，TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡。結果顯示：Con A處理后，肝細胞凋亡增加，而經抗HMGB1抗體預處理的小鼠其細胞凋亡明顯低于對照組。 8．抗HMGB1抗體對肝臟單個核細胞T、NKT細胞亞群的影響 注射Con A后0 h、6 h、12 h，分別取各處理組小鼠肝臟，分離肝臟MNC，雙色標記檢測T、NKT細胞亞群。結果發(fā)現(xiàn)，抗HMGB1抗體組與IgG對照組間T、NKT亞群無顯著差異。 9．抗HMGB1抗體對肝臟單個核細胞T、NKT細胞活化的影響 注射ConA 12 h后，取小鼠肝臟，分離肝臟MNC，以CD69為標記檢測T、NKT細胞活化狀態(tài)。結果顯示： (1)抗HMGB1抗體處理組的CD69~+T細胞占T細胞比例明顯低于IgG對照組。 (2)抗HMGB1抗體處理組的CD69~+NKT細胞占NKT細胞比例明顯低于IgG對照組。 10．Con A誘導的肝損傷與TLR4(HMGB1受體)相關 Con A處理后6 h、12 h、24 h，可見TLR4表達，尤其以6 h為明顯。注射相同劑量Con A，12 h處死動物，取血清檢測ALT。結果發(fā)現(xiàn)：TLR4基因缺陷型小鼠(C3H／Hej)ALT水平明顯低于TLR4野生型小鼠(C3H／HeOuj)。 四、HO-1通過抑制HMGB1表達減輕LPS所致肺損傷 HO-1誘導劑CoPPⅨ能顯著增加肺組織HO-1活性，進而保護LPS所致急性肺損傷，表現(xiàn)為：肺組織中炎性細胞(尤其是中性粒細胞)浸潤減少，肺W／D、肺組織EBA含量降低及肺組織損傷減輕等。其機制可能涉及HO-1上調可抑制TNF-a和HMGB1表達。 五、結論 1．HMGB1參與Con A所致急性肝損傷的發(fā)生與發(fā)展。 2．HMGB1特異性拮抗物能減輕Con A所致肝損傷，其機制可能為：抑制炎性因子釋放；抑制NF-κB活性；抑制肝細胞凋亡；抑制T細胞、NKT細胞活化等。 3．HO-1誘導劑CoPPⅨ能顯著增強肺組織HO-1活性，進而保護LPS所致急性肺損傷，其機制可能與HO-1抑制TNF-a和HMGB1表達有關。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R575;R563.8
【部分圖文】：

華中科技大學博士學位論文PBSIgG+ConAanti一HMGBI+COnA圖3一2肝臟大體觀Fig3· 2MaeroscoPicaPPearaneeofliverat12hafterConAehallenge2.肝臟HE染色:取各組小鼠肝臟制成石蠟切片，常規(guī)HE染色，觀察肝組織壞死和炎性細胞浸潤。結果如圖3一3所示:正常組肝小葉結構正常;模型組肝細胞大面積壞死，多數(shù)肝細胞胞漿明顯腫脹，氣球樣變，壞死區(qū)域有炎性細胞浸潤;抗HMGBI多克隆抗體處理后，肝臟組織損傷明顯減輕。PBS.ConAAntl.HMGBI令ConA圖3一3組織學分析(HE染色)Fig.3· 3HistoP

Fig3· 2MaeroscoPicaPPearaneeofliverat12hafterConAehallenge2.肝臟HE染色:取各組小鼠肝臟制成石蠟切片，常規(guī)HE染色，觀察肝組織壞死和炎性細胞浸潤。結果如圖3一3所示:正常組肝小葉結構正常;模型組肝細胞大面積壞死，多數(shù)肝細胞胞漿明顯腫脹，氣球樣變，壞死區(qū)域有炎性細胞浸潤;抗HMGBI多克隆抗體處理后，肝臟組織損傷明顯減輕。PBS.ConAAntl.HMGBI令ConA圖3一3組織學分析(HE染色)Fig.3· 3HistoPathologyofConA一 treatedliverinmiee53

癡麟娜降翔NF一長月圖3一9抗HMCBI抗體對NF一KB活性的影響 Fig.3.9Effeetofanti一 HMGBIAbonNF一 KBaetivity+一+++ConAIgGAnti~I衛(wèi)城GBI PlKB·a 1工B一ap一aetin圖3一10抗HMGBI抗體對IKB磷酸化的影響 Fig.3.10Effeetofanti一HMGBIAbonIKBPhosPhoryla6
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本文編號：2885191