胰腺纖維化是酒精性慢性胰腺炎(ACP)的一個主要病理學特征,其中胰腺星狀細胞(PSC)起著關鍵作用。靜止期PSC可被酒精、酒精代謝產(chǎn)物和活性氧化物激活,使其轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞樣細胞,表達細胞骨架蛋白α平滑肌肌動蛋白(α-SMA),并具有增殖、合成包括I型膠原(Col1)在內(nèi)的細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的能力。ACP纖維形成過程被認為是酒精誘導胰腺組織損傷后在活化巨噬細胞(Mφ)和PSC之間基于細胞因子相互作用而引起的。事實上,僅有5-10%的酗酒者最終出現(xiàn)具有臨床癥狀的胰腺炎,表明單純酒精因素通常不足以導致臨床足以診斷的胰腺炎。嚙齒類動物模型和患者隊列研究均表明,飲酒會導致腸道微生態(tài)失調(diào)和腸粘膜通透性增加,引起內(nèi)毒素血癥。近十年來,革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)被認為是ACP發(fā)生過程中纖維化形成和PSC激活的觸發(fā)因素。最近,我們的研究發(fā)現(xiàn)伴有內(nèi)毒素血癥的ACP患者血清中單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α),調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平均提高。體外研究我們發(fā)現(xiàn)LPS可激活Mφ和PSC的Toll樣受體4(TLR4),產(chǎn)生趨化因子MCP-1、MIP-1α和RANTES與轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1。盡管已經(jīng)知道LPS在ACP發(fā)病機制中具有有害作用,利用外源性LPS評價內(nèi)毒素在ACP發(fā)病機制中的作用仍然存在局限性。目前尚不清楚LPS在ACP胰腺纖維化形成過程中是啟動因素還是加重因素或兩者兼而有之。此外,ACP發(fā)病過程中Mφ和PSC之間的相互作用以及炎癥和纖維化發(fā)生學之間的分子調(diào)節(jié)機制仍然有待于闡明。本研究我們首先闡明慢性酒精喂養(yǎng)大鼠腸源性內(nèi)毒素LPS水平和胰腺I型膠原含量的關系;進而我們使用慢性酒精喂養(yǎng)加LPS反復注射大鼠模型與Mφ和PSC細胞模型闡述LPS加強TGF-β1信號通路和胰腺纖維化在ACP發(fā)病機制的作用。本論文共分兩部分:第一部分:腸源內(nèi)毒素對慢性酒精喂養(yǎng)大鼠胰腺I型膠原產(chǎn)生的影響目的:本研究旨在評價慢性酒精喂養(yǎng)大鼠門靜脈LPS濃度與胰腺Col1含量之間的關系。方法:雄性SD大鼠66只被隨機分為兩組,分別給予Lieber-De Carli等熱量對照(CON)液體飲食和酒精(ALC)(15 g/kg/d)液體飲食。各11只CON或ALC喂養(yǎng)大鼠在第8,9或10周末致死。動態(tài)比濁法測定門靜脈血漿LPS含量,HE染色用于評估胰腺炎損傷程度,苯胺藍膠原染色用于評價胰腺纖維化程度。免疫組織化學檢測胰腺組織α-SMA和F4/80分別用于識別PSCs和Mφs;RT-q PCR檢測胰腺標本Col1和TLR4 m RNA;Western Blot測定胰腺標本TLR4蛋白;ELISA檢測胰腺趨化因子和TGF-β1。結果:與CON大鼠相比10周末ALC喂養(yǎng)大鼠胰腺炎癥評分升高,兩組之間膠原沉積無顯著性差異。ALC喂養(yǎng)大鼠門靜脈LPS水平和胰腺TLR4、Col1A1 m RNA及蛋白水平都呈現(xiàn)時間依賴性增加,高峰發(fā)生在10周末。此外,在8周末ALC喂養(yǎng)大鼠胰腺TLR4和Col1A1 m RNA表達量與CON大鼠相比明顯增加,而門靜脈LPS水平無明顯變化。10周末ALC喂養(yǎng)大鼠胰腺PSC和Mφ數(shù)量及趨化因子(MCP-1,MIP-1α和RANTES)、TGF-β1或Col1A1的表達都顯著增加,它們各自與門靜脈LPS水平呈正相關。結論:本研究表明腸源性內(nèi)毒素LPS與酒精誘導胰腺纖維化有關,靶向細菌內(nèi)毒素有可能成為ACP比較有前景的治療策略。第二部分:外源性LPS通過上調(diào)TGF-β1信號通路增加大鼠胰腺纖維化目的:本研究旨在探討外源性LPS調(diào)節(jié)TGF-β1信號傳導和胰腺纖維化的機制。方法:22只120 g±20 g雄性SD大鼠喂養(yǎng)Lieber-De Carli酒精(ALC)液體飲食10周,在最后3周分成LPS注射組和非LPS注射組。LPS組于8,9,10周末每周經(jīng)尾靜脈注射LPS(3 mg/kg)1次,對照組尾靜脈注射生理鹽水1 ml。10周末接受LPS或生理鹽水24 h后大鼠被異氟烷麻醉,留取胰腺組織塊,其中部分組織塊放入10%中性福爾馬林液固定,用于制備石蠟切片,部分組織塊放入液氮中保存。采用本研究室經(jīng)RSV啟動子/增強子驅(qū)動SV40 T抗原建立的永生化大鼠胰腺星狀細胞系(RP-2細胞)進行體外研究。采用淋巴細胞分離液分離大鼠末梢血單核細胞,經(jīng)粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)誘導培養(yǎng)6天獲得組織Mφs用于LPS體外造模研究。苯胺藍膠原染色用于評價胰腺纖維化程度。免疫組織化學檢測胰腺組織TLR4,BAMBI,α-SMA和F4/80,后兩者分別用于識別PSC和Mφ;免疫熒光雙染用于識別胰腺組織TLR4+Mφs/TLR4+PSC或者TGF-β1+Mφ/TGF-β1+PSC。RT-q PCR用于測定RP-2細胞Col1A1、α-SMA、TLR4和BAMBI m RNA水平;Western blot用于測定RP-2細胞Col1和α-SMA蛋白水平與評價TGF-β1/Smad2/3和TLR4/My D88/NF-k B信號通路;ELISA用于測定胰腺標本與Mφ和RP-2細胞Col1A1和TGF-β1蛋白含量。結果:與單純ALC喂養(yǎng)大鼠相比,LPS反復注射可顯著增加ALC喂養(yǎng)大鼠胰腺膠原產(chǎn)生和PSC活化。在ALC喂養(yǎng)大鼠加上LPS反復注射可引起胰腺TLR4或TGF-β1過表達,TLR4+或TGF-β1+Mφ或PSC數(shù)量增加。體外實驗顯示LPS可上調(diào)Mφ或RP-2細胞TLR4或TGF-β1產(chǎn)生。在血清饑餓的RP-2細胞LPS單獨或與TGF-β1聯(lián)合刺激下可顯著提高Col1和α-SMA產(chǎn)生及Smad2和Smad3磷酸化。LPS可抑制TGF-β1偽受體BAMBI產(chǎn)生,其可被TLR4干擾RNA(Si-TLR4 RNA)或My D88/NF-k B抑制劑拮抗。此外,Si-BAMBI RNA敲除BAMBI可顯著加強RP-2細胞TGF-β1信號通路。結論:本研究表明LPS通過PSC自分泌和Mφ旁分泌途徑增加TGF-β1產(chǎn)生,LPS通過激活TLR4/My D88/NF-k B通路抑制BAMBI表達,上調(diào)PSC中TGF-β1信號通路。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

圖 1.1 LPS-TLR4 信號通路模式圖-TLR4 通路與 NF-κB 通路的關系 為一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括 5 個亞單位：Rel（cR-κB3）、RelB 和 p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）。其中源和/或異源二聚體與靶基因上特定的 DNA 序列（-κB因轉(zhuǎn)錄，不同的 NF-κB 二聚體在選擇結合序列時可能略 通過不同的二聚體的形式對不同基因表達進行激活或

吉 林 大 學 博 士 學 位 論 文34圖2.1 酒精對大鼠胰腺炎癥反應和膠原沉積的作用對照飼料喂養(yǎng)（CON）和酒精喂養(yǎng)（ALC）大鼠胰腺組織典型HE染色切片。1個（A）或多個炎細胞浸潤和腺泡細胞水腫（B）。ALC喂養(yǎng)大鼠胰腺組織學評分高于CON組（C）。胰腺組織內(nèi)膠原沉積面積計量分析兩組之間無統(tǒng)計學差異（D）。（放大倍數(shù)，×400；**P<0.01）2.4.2 酒精暴露大鼠 Col1A1 mRNA 和蛋白質(zhì)含量呈時間依賴性增加由于 Col1 是正常和疾病狀態(tài)下胰腺 ECM 的主要成分[61,62]，我們分別在第 8、9 或 10 周末通過 qRT-PCR 和 ELISA 法測量了各組胰腺組織樣本中 Col1A1 mRNA 或蛋白質(zhì)含量。結果顯示：酒精喂養(yǎng)大鼠胰腺 Col1A1mRNA 和蛋白含量均呈時間依賴性增加，第 10 周末達到最高水平。然而，與對照大鼠相比 8 周末酒精喂養(yǎng)大鼠胰腺 Col1A1 mRNA 表達顯著增強，Col1A1 蛋白水平盡管在酒精喂養(yǎng)組增加了 39%，但是沒有統(tǒng)計學意義 (圖

圖 2.2 酒精喂養(yǎng)組（ALC）大鼠胰腺中 Col1A1 mRNA 和蛋白的含量第 8，9，10 周末分別收集 ALC 組和 CON 組大鼠胰腺組織標本，ALC 喂養(yǎng)大鼠胰腺中 Col1A1 mRNA(A)和蛋白(B)含量呈現(xiàn)時間依賴性增加，最高水平出現(xiàn)在第 10周末。（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001）2.4.3 慢性酒精暴露對 PSC 和巨噬細胞活化的影響由于 PSC 在疾病狀態(tài)下胰腺的 ECM 合成中發(fā)揮關鍵作用，其與與Mφ相互作用，通過細胞因子調(diào)節(jié)而啟動 ACP 纖維形成[63,64]，本研究采用Col1和α-SMA雙重免疫組織化學染色檢測胰腺PSC中是否具有Col1沉積。結果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù) Col1 能在 PSC 中檢測到，而產(chǎn)生 Col1 的 PSC 在對照大
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本文編號：2885141