骨髓源性肝干細(xì)胞(Bone marrow derived liver stem cells, BMDLSC)是指骨髓干細(xì)胞中可以分化形成肝細(xì)胞的特定干細(xì)胞群。這類干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),為肝臟疾病治療提供了新思路和新手段。小鼠BMDLSC移植實(shí)驗(yàn)證實(shí),BMDLSC對CCL4及酒精所致小鼠肝纖維化具有逆轉(zhuǎn)作用。但是在生理狀態(tài)下定居在骨髓內(nèi)的BMDLSC,為什么在移植后會(huì)向肝臟遷移并發(fā)揮修復(fù)作用,調(diào)控移植后BMDLSC向肝臟遷移的因素又有哪些,它們又是如何調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的,這些問題目前都未明了。 近些年來,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)趨化因子有可能是驅(qū)使BMDLSC向肝臟遷移的一個(gè)重要因素,其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-la (SDF-1a)已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)可以驅(qū)使CXCR4陽性的骨髓源性肝干細(xì)胞向肝內(nèi)聚集并誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化，我們此前的臨床研究也觀察到SDF-1a在肝臟發(fā)生纖維性增生時(shí)表達(dá)增多,并且表達(dá)數(shù)量與肝纖維化程度相關(guān),提示SDF-1a在人體內(nèi)同樣有可能是趨勢BMDLSC向肝臟遷移的一個(gè)重要因素。在體外試驗(yàn)中,單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1,系統(tǒng)命名為CCL2)、調(diào)節(jié)活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(Rantes,系統(tǒng)命名為CCL5)、人單核細(xì)胞趨化蛋白-3(MCP-3,系統(tǒng)命名為CCL7)、人二級淋巴組織趨化因子(SLC,系統(tǒng)命名為CCL21)和人胸腺表達(dá)趨化因子(TECK,系統(tǒng)命名為CCL25)等趨化因子可以驅(qū)使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向其濃度遞增方向遷移,且趨化能力大小與上述趨化因子的濃度成正相關(guān)。提示這些趨化因子在體內(nèi)也有可能是調(diào)控BMDLSC向肝臟遷移的的因素。但是,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25在肝臟的表達(dá)情況至今仍未見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)對正常肝組織和肝纖維化與肝硬化肝組織中趨化因子CCL2、CCL5. CCL7、CCL21和CCL25的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。方法參照人ELISA試劑盒內(nèi)所附的操作說明。結(jié)果顯示,肝臟發(fā)生肝纖維性增生損傷時(shí),肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的含量顯著增加,隨著病變由肝纖維化向肝硬化發(fā)展,肝組織中CCL2、CCL5、CCL21和CCL25水平也進(jìn)一步升高,但CCL7水平呈下降趨勢。 [材料和方法] 1.肝組織取自30例病人,均來自2008年5月-2009年5月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)(包括肝移植)的病人。其中男性17例,女性13例。年齡19-77歲,平均50歲。30例標(biāo)本共分為3組： ①正常對照組(n=9)：乙肝表面抗原陰性,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能正常(轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、血清白蛋白、凝血酶原時(shí)間),Child-Pugh肝功能分級評估為A級,肝組織病理學(xué)檢查顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常。 ②肝纖維化組(n=10)：乙肝表面抗原陽性,有或無乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能正�；虍惓�,Child-Pugh肝功能分級評估為A級,組織病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)纖維化組織增生,但無假小葉形成。 ③肝硬化組(n=11)：乙肝表面抗原陽性,有或無乙型肝炎病史,丙肝抗體陰性,肝臟生化功能檢查輕度至重度異常,Child-Pugh肝功能分級評估為A-C級,病理學(xué)檢查顯示肝內(nèi)廣泛纖維組織增生,肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,假小葉及再生結(jié)節(jié)形成。 2.觀察指標(biāo)與方法 2.1臨床癥狀與體征體查確認(rèn)患者有無黃疸,有無肝掌與癡蛛痣,有無腹腔積液,有無肝性腦病,以及這些癥狀體征的程度。 2.2影像學(xué)檢查肝臟CT掃描和肝臟B型超聲檢查。 2.3實(shí)驗(yàn)室檢查乙肝兩對半、丙肝抗體試驗(yàn),手術(shù)當(dāng)天抽血查肝臟生化功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)、血清總膽紅素(TBIL)、凝血酶原時(shí)間(PT)。 2.4組織病理學(xué)檢查肝組織經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟至水及HE染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察。 2.5肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量的測定 2.5.1肝組織的勻漿、離心精確稱重肝組織后移入微量手動(dòng)玻璃勻漿器中于低溫環(huán)境中徹底勻漿,按比加入1×PBS緩沖液將勻漿組織洗下并轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中,在低溫高速離心機(jī)中以4℃、1000×g離心力離心10min,提取上清液移至另一1.5ml EP管中,再次于4℃下25000×rpm離心20min,取上清液待測。 2.5.2 ELISA法測定以上五種趨化因子的含量采用雙抗體夾心ELISA法,即將上述五種趨化因子與包被于酶標(biāo)板上的單抗結(jié)合后,再結(jié)合生物素化相應(yīng)的趨化因子抗體,加入底物A和B進(jìn)行顯色,在酶標(biāo)儀上讀取450nm的波長OD值,趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25的濃度與分別與對應(yīng)的OD值成比,用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行曲線擬合,得到擬合效果最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線后,再計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,最后求出標(biāo)本離心液中的趨化因子的濃度。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 最終計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。行×列表資料采用χ2檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較,如方差齊性采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD兩兩比較；如方差不齊,則采用Welch近似方差分析及Dunnett's T3兩兩比較；相關(guān)分析數(shù)據(jù)總體符合雙變量正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)系數(shù)表示,不符合雙變量正態(tài)分布的采用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。所有統(tǒng)計(jì)分析中,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 [結(jié)果] 1.正常組、肝纖維化組、肝硬化組趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量 1.1正常組、肝纖維化組、肝硬化組的CCL2含量分別為(0.46±0.34)、(19.30±4.26)和(81.23±11.47)pg/mg;肝硬化組的含量高于正常組(P=0.000)和肝纖維化組(P=0.000),肝纖維化組的含量高于正常組(P=0.000)。 1.2正常組、肝纖維化組、肝硬化組的CCL5含量分別為(0.30±0.37)、(0.88±0.52)和(3.75±1.45)pg/mg;肝硬化組的含量高于正常組(P=0.000)和肝纖維化組(P=0.000),肝纖維化組的含量于正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.200)。 1.3正常組、肝纖維化組、肝硬化組的CCL7含量分別為(2.03±1.14)、(5.09±1.51)和(4.57±1.42)pg/mg。肝纖維化組(P=0.000)和肝硬化組(P=0.000)含量顯著高于正常組,肝硬化組的含量低于肝纖維化組,但肝硬化組與肝纖維化組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.390)。 1.4正常組、肝纖維化組、肝硬化組的CCL21含量分別為(0.14±0.21)、(0.92±0.69)和(3.22±1.45)pg/mg;肝硬化組的含量高于正常組(P=0.000)和肝纖維化組(P=0.000),肝纖維化組和正常組CCL21的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.092)。 1.5正常組、肝纖維化組、肝硬化組的CCL25含量分別為(4.06±2.23)、(14.46±4.10)和(21.97±2.98)pg/mg;肝硬化組的含量高于正常組(P=0.000)和肝纖維化組(P=0.000),肝纖維化組的含量高于正常組(P=0.000)。 2.肝組織中趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25含量與肝臟生化功能指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果 2.1 CCL2、CCL5、CCL21和CCL25與ALT、AST的相關(guān)性分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05), CCL2、CCL5、CCL21和CCL25與PT的相關(guān)性分析亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但相關(guān)系數(shù)均較小。 2.2 CCL7與AST相關(guān)性分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但相關(guān)系數(shù)亦較小；與肝功能余指標(biāo)相關(guān)性分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3肝內(nèi)趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25相互間的相關(guān)性分析表明,CCL2與CCL5、CCL21、CCL25間的相關(guān)系數(shù)(r)均在0.812以上,且相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01); CCL5與CCL21和CCL25的相關(guān)系數(shù)分別為0.584(P0.01)、0.788 (P0.01); CCL21與CCL25的相關(guān)系數(shù)為0.728(P0.01)；但CCL7除與CCL25相關(guān)性(r=0.550)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,與其他趨化因子相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)論] 1.本研究的觀察結(jié)果表明,肝臟不僅有CCL2、CCL5、CCL7、CCL21和CCL25表達(dá),而且在肝臟發(fā)生纖維增生性損害時(shí),肝內(nèi)表達(dá)這些趨化因子的數(shù)量顯著增加。隨著肝損傷程度的加重,肝內(nèi)趨化因子的含量逐步增加,至肝纖維化階段,肝內(nèi)CCL7的含量達(dá)到高峰。至肝硬化階段,肝內(nèi)CCL2、CCL5、CCL21、CCL25的含量達(dá)到高峰。但是這些趨化因子在肝臟發(fā)生纖維性損傷時(shí)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的意義及其在BMDLSC向肝臟遷移過程中的調(diào)控作用有待進(jìn)一步探索。 2.肝內(nèi)趨化因子的含量與肝功能指標(biāo)的相關(guān)分析表明：CCL2、CCL5、CCL21和CCL25在肝臟的表達(dá)數(shù)量與ALT和AST的變化呈顯著性正相關(guān),提示這四種趨化因子在肝臟的表達(dá)水平也可以作為判斷有無肝臟損傷的指標(biāo)。肝細(xì)胞受到損傷時(shí),肝臟表達(dá)這四種趨化因子的表達(dá)數(shù)量增多；CCL7在肝臟的含量雖然也與ALT和AST的變化呈正相關(guān),但相關(guān)系數(shù)僅0.337和0.380,提示CCL7在肝臟的含量高低與肝臟有無細(xì)胞損傷的關(guān)系不大,CCL7不能作為判斷有無肝臟損傷的指標(biāo)。 3. CCL2、CCL5、CCL7、CCL21、CCL25這五種趨化因子之間的相關(guān)性分析顯示,CCL2、CCL5、CCL21、CCL25這四種趨化因子之間相關(guān)系數(shù)均在0.728以上,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示這四種趨化因子的表達(dá)機(jī)制可能存在相似之處；CCL7與CCL2、CCL5、CCL21、CCL25相關(guān)性分析中僅與CCL25的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但相關(guān)系數(shù)r僅為0.550,與CCL2、CCL5、CCL21的相關(guān)系數(shù)均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示CCL7的表達(dá)調(diào)控可能不同于其它趨化因子的表達(dá)調(diào)控。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

碩士學(xué)位論文細(xì)胞大小形態(tài)正常，胞漿勻染，偶見正常凋亡的細(xì)胞，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，未見纖維組織沉積，見圖1一5、圖1一6。圖l一l:纖維化肝組織 (HEX100)圖l一2:纖維化肝組織 (HEx200)Fig，l一 3Livertissueofliverfibrosis(HEFig.l一 4Livertissueofliverfibrosis(HE X100)X200)圖l一3:肝硬化肝組織 (HEx100)Fig.l一 5Livertissueofeirrhosis(HEX100)圖l一4:肝硬化肝組織 (HEx200)Fig.l一 6Livertissueofeirrhosis(HEX200)圖l一5:正常肝組織 (HEx100)Fig.l一 1Normallivertissue(HEX100)圖1一6:正常肝組織 (HEx200)Fig.l一 2Normallivertissu

尸一0.000。見圖2一2。2.1.2.2肝組織內(nèi)CCLS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)換算同上述CCLZ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)換算(下同)趨化因子CCLS標(biāo)準(zhǔn)晶含量(pglmL)400.00 0oD仁—曲線300.00200刀D100刀00， 000250， 5007510D125150OD位圖2一2:趨化因子CCLS標(biāo)準(zhǔn)品的擬合曲線 F19.2一 2showsthefittingeurveofehemokineCCL5standardsandtheODvalue. 2.1.3 2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及樣本CCL7濃度計(jì)算趨化因子CCL7標(biāo)準(zhǔn)品濃度及OD值見表2一3。

+41.09弧3:尺2一1.000，介5750.779，尸一0.000。見圖2一5。2.1.5.2肝組織內(nèi)CCL25的質(zhì)量分?jǐn)?shù)換算趨化因子CCL25標(biāo)準(zhǔn).1矛.含址(PglmL)40D.0D 0oD位—由1線300.0020DD0 100刀O一一一OD植圖2一5:趨化因子CCL25標(biāo)準(zhǔn)品的擬合曲線 F19.2一 5showsthefittingeurveofehemokineCCL25standardsandtheODvalue.2.2正常對照組、肝纖維化組和肝硬化組肝內(nèi)趨化因子CCLZ、CCLS、CCL7、CCLZI和CCL25的表達(dá)水平比較。經(jīng)Levene經(jīng)驗(yàn)，CCLS(F=3.349， P=0.050)、CCL7(F=0.352，P=0.706)、CCLZI(F=3.151，P=0.259)和CCL25(F=1.097，P=0.348)多組均數(shù)方差齊性ANOVA)及LSD兩兩t匕較;CCLZ(F=10.351應(yīng)用單因素方差分析(one一wayP=0.000)方差不齊，采用Weleh近似方差分析及Dulmett’ 5T3兩兩比較;檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
【參考文獻(xiàn)】

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