本研究通過選用不同生物及化學(xué)分化體系對由大鼠2-AAF/PH　模型分離出的肝卵圓細(xì)胞及WB-F344　細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)胞肝、膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào),干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減弱或消失,形態(tài)學(xué)也發(fā)生相應(yīng)改變,實現(xiàn)體外培養(yǎng)肝前體細(xì)胞可控的向肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞分化。同時我們通過聯(lián)合運用iTRAQ技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)研究肝WB-F344細(xì)胞在體外向膽管細(xì)胞分化過程中的差異蛋白的動態(tài)表達(dá),篩選與分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)及可能做為卵圓細(xì)胞特異標(biāo)志物的蛋白。質(zhì)譜結(jié)果鑒定出了1278個差異蛋白,對67個發(fā)生明顯上調(diào)或下調(diào)的蛋白進(jìn)行了鑒定及功能學(xué)檢測。本研究表明ITRAQ技術(shù)是研究培養(yǎng)細(xì)胞動態(tài)差異蛋白組學(xué)的有效方法,檢驗出的差異蛋白可能與卵圓細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。　
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

一、大鼠 2-AFF/PH 模型分離肝卵圓細(xì)胞的特征：2-AFF灌喂大鼠在行2/3肝切除術(shù)后約4－12天內(nèi)可見膽管增生反應(yīng)和膽管周圍的卵圓細(xì)胞反應(yīng)，于第9 天達(dá)到最明顯。卵圓細(xì)胞增生部位多位于匯管區(qū)及小葉間膽管附近，所見到的肝卵圓細(xì)胞體積較小，卵圓細(xì)胞核呈卵圓形，胞質(zhì)較少，嗜酸性弱，肝卵圓細(xì)胞大小及分布不均勻(圖1-A、B)。呈簇狀分布且由匯管區(qū)向肝實質(zhì)內(nèi)延伸。經(jīng)二部膠原酶消化法分離出的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，5 天后我們即可見克隆樣生長的上皮樣細(xì)胞(圖1-C)形體小，核漿比例大，細(xì)胞折光性強。經(jīng)純化后卵圓細(xì)胞記為第一代，待細(xì)胞長至80%滿時1:3 傳代,約3－5 天傳一代。相差顯微鏡觀察細(xì)胞直徑約10-15μm，呈鋪路石樣排列多角形。形態(tài)較均一，折光性強，核大，卵圓形，胞漿少，核仁明顯，細(xì)胞之間有接觸抑制(圖1-D)。細(xì)胞融合培養(yǎng)時可見迅速消亡。

且抑制作用隨濃度增高及作用時間延長，而 0.75、2.25mmol/L 作用組丁酸鈉其光密度值與對照組無明顯差別（圖 1-2A）；6.25mmol/L 丁酸鈉誘導(dǎo)組細(xì)胞生長狀況不佳，培養(yǎng)第 2 天即可見到較多細(xì)胞脫壁死亡，殘余折光性弱，邊界模糊(圖 1-2B)。在以下分化實驗中我們選取 3.75 和 5.25mmol/L 丁酸鈉進(jìn)行誘導(dǎo)實驗。幾種分化體系對培養(yǎng)細(xì)胞均有抑制作用，其抑制作用在卵圓細(xì)胞和 WB－F344 細(xì)胞間無明顯區(qū)別。圖 1-3 為卵圓細(xì)胞在各分化體系中的生長曲線圖:丁酸鈉體系對誘導(dǎo)細(xì)胞的抑制作用最強，顯微鏡下觀察該體系內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組；HGF+EGF 體系對誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制最低，鏡下可發(fā)現(xiàn)卵圓細(xì)胞在該體系中形態(tài)于數(shù)量與對照組無明顯區(qū)別，WB-F344 細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的細(xì)胞較多，但周圍仍可觀察到較多相對正常的細(xì)胞。

圖 1-3 不同分化體系作用于卵圓細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況（二）分化體系對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響卵圓細(xì)胞在丁酸鈉誘導(dǎo)下，處理 2 天后相差顯微鏡顯示細(xì)胞形態(tài)展面積增大，生長停止，細(xì)胞核變大，胞漿也相應(yīng)增加，核漿比減�。˙）。第三天可見出現(xiàn)雙核或多核細(xì)胞第七天基本上見不到鋪路石樣卵圓3.75、4.5 mmol/L 的丁酸鈉誘導(dǎo)的 WB-F344 細(xì)胞形態(tài)改變與卵圓細(xì)胞處理 1 天后相差顯微鏡顯示 WB-F344 細(xì)胞形態(tài)變平，大小要略小于誘卵圓細(xì)胞，細(xì)胞成圓形或橢圓形，生長減慢，細(xì)胞間距離增大，細(xì)胞核核質(zhì)比減小，5 天基本上見不到原始狀態(tài)的 WB-F344 細(xì)胞（圖 1-5 C）。在 Matrigel 上培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞和 WB－F344 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有均變，相差顯微鏡顯示培養(yǎng)第 2 天細(xì)胞間可見到繩索樣結(jié)構(gòu)，由拉伸成的細(xì)胞組成；其余細(xì)胞的生長停止，細(xì)胞呈島樣聚集。相對對照細(xì)胞，
【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2882799