發(fā)布時間：2020-11-12 17:24

　　 目的:肝纖維化是一種可逆的創(chuàng)傷性修復(fù)過程,細(xì)胞外基質(zhì)合成增多降解相對減少;作為肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)主要來源的肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化中的關(guān)鍵病理病變;外泌體是一種細(xì)胞分泌的膜性小囊泡,在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用。我們推測肝星狀細(xì)胞活化過程中釋放的外泌體可參與肝臟受損修復(fù)。本文旨在探索肝星狀細(xì)胞外泌體如何影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,并從細(xì)胞能量代謝的角度如有氧糖酵解(瓦爾堡效應(yīng))的角度探討外泌體對肝星狀細(xì)胞活化的調(diào)控機制,以及對肝內(nèi)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的可能作用,進一步研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展機制,為逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供理論依據(jù)。方法:提取肝星狀細(xì)胞外泌體,用電鏡、Western blot和乙酰膽堿脂酶(AchE)活性測定試劑盒鑒定外泌體;以CoCl_2缺氧或LPS誘導(dǎo)處理人肝星狀細(xì)胞LX-2,繼而用Hif-1抑制劑2-ME或外泌體抑制劑GW4869抑制Hif-1表達(dá)或外泌體分泌,用AchE活性測定試劑盒測定外泌體分泌,Western blot檢測Hif-1或肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)記分子α-SMA,免疫熒光染色技術(shù)(Immunofluorescence,IF)檢測2-NBDG攝取;用Western blot和IF檢測以CoCl_2缺氧或LPS誘導(dǎo)處理LX-2細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清外泌體內(nèi)糖酵解相關(guān)分子GLUT1和PKM2表達(dá);將活化的肝星狀細(xì)胞外泌體與靜息肝星狀細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育,IF檢測外泌體的攝取,Western blot檢測GLUT1、PKM2、α-SMA和VEGF的表達(dá)。結(jié)果:LX-2細(xì)胞外泌體具有外泌體典型結(jié)構(gòu),表達(dá)外泌體特異性分子,具有乙酰膽堿脂酶活性;LX-2細(xì)胞缺氧或LPS處理后,細(xì)胞外泌體分泌增多,2-ME抑制Hif-1表達(dá),外泌體分泌受到抑制;GW4869抑制外泌體分泌,缺氧或LPS處理后LX-2細(xì)胞內(nèi)Hif-1和活化標(biāo)記分子α-SMA表達(dá)受到抑制,缺氧條件下LX-2細(xì)胞葡萄糖攝取受到抑制。LX-2細(xì)胞缺氧或LPS處理后,細(xì)胞內(nèi)和上清外泌體中糖酵解相關(guān)分子GLUT1和PKM2表達(dá)升高;活化的LX-2細(xì)胞外泌體能引起靜息的LX-2細(xì)胞活化,GLUT1、PKM2、α-SMA和VEGF表達(dá)升高;活化的LX-2細(xì)胞外泌體能誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)GLUT1和PKM2表達(dá)升高。結(jié)論:肝星狀細(xì)胞可分泌外泌體,其外泌體分泌受Hif-1核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控;外泌體參與LX-2細(xì)胞活化和能量代謝進程;肝星狀細(xì)胞活化時產(chǎn)生的外泌體含有GLUT1和PKM2等糖酵解相關(guān)分子,其外泌體可被靜息肝星狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞受納,并引起受納細(xì)胞內(nèi)GLUT1和PKM2升高,提示受納細(xì)胞發(fā)生瓦爾堡效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

圖 1.LX-2 人肝星狀細(xì)胞可分泌外泌體。LX-2 細(xì)胞用去外泌體培養(yǎng)液培養(yǎng) 24h 后，收集上清液用外泌體提取試劑盒提取外泌體。（A）2%磷鎢酸處理外泌體，透射電子顯微鏡下觀察，采集像分析；（B）用 Western blot 檢測外泌體中 GRP94、TSG101 和 CD9 蛋白的表達(dá)，并用 LX-2胞裂解液作為對照；（C）外泌體 AchE 活性用乙酰膽堿脂酶試劑盒測定，PBS 為陰性對照。該驗用不同批次樣品重復(fù) 3 次，并作統(tǒng)計學(xué)分析（p<0.05），結(jié)果用 Mean ±SD 表示。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文2．LX-2 肝星狀細(xì)胞外泌體的分泌受 Hif-1 核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本課題組前期已證實在 CoCl2缺氧誘導(dǎo)和 LPS 炎癥因子刺激時，LX-2 細(xì)胞內(nèi)缺誘導(dǎo)因子 Hif-1 表達(dá)升高，且 Hif-1 可以調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化。有研究表明，Hif-1表達(dá)是影響外泌體分泌的重要因素。AchE 活性用于檢測缺氧和 LPS 刺激條件下外體的分泌量，結(jié)果表明，缺氧和 LPS 刺激條件下，LX-2 細(xì)胞外泌體分泌升高（圖 2A）Hif-1 特異性抑制劑 2ME 抑制 Hif-1 表達(dá)時，LX-2 細(xì)胞外泌體分泌受到抑制（圖 2A）Western blot 檢測外泌體特異性蛋白 TSG101 表達(dá)，結(jié)果與 AchE 活性檢測一致，缺和 LPS 刺激促進 LX-2 細(xì)胞外泌體分泌，2ME 抑制 Hif-1 可明顯抑制 LX-2 外泌體分（圖 2B）。以上結(jié)果證實，Hif-1 調(diào)控 LX-2 肝星狀細(xì)胞外泌體的分泌。

30圖 3. 抑制外泌體的分泌可抑制缺氧或 LPS 誘導(dǎo)下 LX-2 肝星狀細(xì)胞活化和 Hif-1 表達(dá)，并阻遏胞缺氧條件下葡萄糖吸收。（A）將 LX-2 肝星狀細(xì)胞用 10μM 外泌體抑制劑 GW4869 預(yù)處理后，用 100μM CoCl2誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧或用 2ug/ml LPS 刺激細(xì)胞，在 0h、1h 和 8h 收集細(xì)胞內(nèi)總蛋白Western blot 檢測 Hif-1、α-SMA 以及內(nèi)參 β-actin 的表達(dá)。（B）在 100μM CoCl2刺激條件下，（C在 2ug/ml LPS 刺激條件下，Hif-1、α-SMA 的表達(dá)水平做統(tǒng)計學(xué)分析，該實驗用不同批次樣品重3 次，結(jié)果用 Mean ± SD 表示，*：P<0.05，**：P<0.01, ***：P<0.001。（D）將 LX-2 肝星狀胞接種于放置了蓋玻片的六孔板中，control 組不作處理，CoCl2組誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧 1h，GW4869同時加入 GW4869 和 100μM CoCl2處理細(xì)胞 1h，加入帶綠色熒光的 2-NBDG，用免疫熒光顯微觀察細(xì)胞對葡萄糖的吸收，綠色：2-NBDG，藍(lán)色：DAPI，200×。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李壽星;從一摩爾葡萄糖氧化產(chǎn)生38分子ATP說起──對農(nóng)業(yè)院校教材使用量與單位深層次問題的調(diào)查[J];湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1998年03期

本文編號：2881021