RNA干擾為治療人類疾病提供了一個很有前景的方法。前期已有一些學(xué)者對于RNAi抗HBV做過研究,但是每個研究小組設(shè)計的siRNA分子對病毒的抑制效果有明顯的差異,因此還需在HBV的干擾靶點上做大量的工作；另外大多研究進行的都是siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染,未構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體系,不能觀察清除HBV RNA的遠期效果；目前臨床應(yīng)用的抗病毒藥物也都需要進行長期治療,包括干擾素、核苷酸類似物,RNA干擾的作用亦需持久。 病毒基因突變是RNA干擾抗病毒失敗的重要原因,針對病毒可逃逸RNAi作用的特點,我們設(shè)計了可在體內(nèi)同時表達兩個microRNA,靶向不同位點的串聯(lián)序列amiRNA。即便是病毒一個基因位點的突變就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干擾作用。miRNA在體內(nèi)之所以能廣泛存在并發(fā)揮作用,是因為它的特點是只要骨架與靶RNA相同,單一一個位點的變化不會影響其發(fā)揮作用。目前對于乙肝病毒的研究已從最初的化學(xué)合成siRNA、shRNA質(zhì)粒載體等向應(yīng)用性較強的microRNA的研究過渡。 盡管有學(xué)者用化學(xué)合成的多個siRNA同時作用于一個細胞,證實了靶向多個區(qū)域基因的可行性,但其為劑量依賴性的,需經(jīng)常向體內(nèi)注入siRNA。通過質(zhì)粒等載體在細胞內(nèi)表達miRNA或siRNA不僅經(jīng)濟方便,還可進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,使小干擾RNA持續(xù)表達,延長對目的基因的抑制時間。質(zhì)粒載體能介導(dǎo)更長期的干擾效果,而過多的質(zhì)粒載體可能對細胞造成一定的影響。串聯(lián)序列表達載體的優(yōu)點就在于只需導(dǎo)入一個質(zhì)粒載體就可發(fā)揮作用。amiRNA使得導(dǎo)入的外源性基因在體內(nèi)自然形成miRNA成為可能,并可同時表達多條miRNA。 有學(xué)者利用polⅡ啟動子表達多個串聯(lián)的shRNAs,從而抑制了多個基因的表達,其對應(yīng)蛋白的表達都有明顯降低。但有研究提出siRNA可誘導(dǎo)IFN反應(yīng),從而存在一些安全性問題。相對于siRNA,由polⅡ啟動子介導(dǎo)的amiRNA技術(shù)被證實不會引起宿主的免疫反應(yīng),亦沒對miRNA的內(nèi)源性途徑產(chǎn)生影響,安全有效。有研究采用該種方法將2個串聯(lián)序列amiRNA導(dǎo)入細胞,但未取得更好的干擾效果,可能是因為并沒有找到最佳的干擾序列。另外,關(guān)于串聯(lián)序列amiRNA在HBV DNA水平的干擾效果,尤其是cccDNA方面的干擾效率未見報道。HBV是一個DNA病毒,但必須經(jīng)過前基因組RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,使得RNA干擾得以發(fā)揮作用,臨床中HBV DNA的檢測更為實用。cccDNA是HBV的源泉,使得對它的觀察更為重要。因為其半衰期較長,所以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染更能接近臨床研究情況。 目的：本文結(jié)合以往研究的經(jīng)驗,針對HBV容易變異的特點,力圖尋找針對HBV基因組保守區(qū)域的多個有效干擾位點；將構(gòu)建的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15,檢測各個序列在RNA水平對HBV的干擾效率；挑選干擾效果好的序列,優(yōu)化設(shè)計并構(gòu)建針對不同位點的串聯(lián)序列amiRNA表達載體；通過瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選,全面研究單一序列及串聯(lián)序列amiRNA表達載體在抑制HBV RNA、DNA和蛋白質(zhì)表達及cccDNA方面的效果。 方法： 1.針對病毒容易變異而逃逸RNAi作用的特點,我們首先利用生物信息學(xué)軟件找到不同基因型HBV基因的保守區(qū)域,避開臨床常見的病毒變異位點選取4個HBV的RNAi靶位點,分別靶向HBV的S區(qū)或X區(qū)。 2.利用microRNA設(shè)計軟件,設(shè)計4條microRNA序列,并構(gòu)建四個以CMV為啟動子的內(nèi)源性miR155為骨架的amiRNA表達質(zhì)粒,分別命名為amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。 3.將構(gòu)建成功的4個amiHBV表達載體分別瞬時轉(zhuǎn)染到含有HBV-DNA全基因的人肝母細胞瘤HepG2.2.15細胞株,從mRNA水平研究單一序列amiHBV對HBV mRNA干擾效果,篩選干擾效率高的amiRNA序列,將其中2條干擾效率較高的單一序列串聯(lián),構(gòu)建串聯(lián)序列amiRNA表達質(zhì)粒(amiHBV-3-4)。 4.將串聯(lián)序列amiHBV表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細胞,因為ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的實驗中將其舍去。采用實時定量熒光PCR法分別檢測細胞培養(yǎng)上清液和細胞內(nèi)的HBV DNA；采用CMIA法(Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)定量檢測分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平變化。 5.通過轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細胞株的篩選,建立amiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞株,采用熒光實時定量檢測試劑盒,對amiRNA干擾HBV的復(fù)制根源cccDNA的效果進行了研究。 結(jié)果 1.本研究中4個不同靶位的amiRNA載體被構(gòu)建,4個單一序列及1條串聯(lián)序列amiHBV表達載體均經(jīng)測序驗證構(gòu)建成功。 2.4個單一序列amiHBV表達質(zhì)粒以amiHBV-4對HBV mRNA的抑制率最高可達75.6%, amiHBV-3對HBV mRNA的抑制率為61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2對HBVmRNA的抑制率僅為29.3%及14.9%；其中串聯(lián)序列amiHBV 3-4的干擾效率為87.2%,串聯(lián)序列組的干擾效率高于單一序列組。 3.各組質(zhì)粒對培養(yǎng)細胞上清中HBV DNA的干擾效率以串聯(lián)序列質(zhì)粒組最高可達到94.3%,單一序列組中干擾效率最高的分別為amiHBV-3組60.5%和amiHBV-4組68.0%。對細胞內(nèi)HBV DNA的干擾效率amiHBV-3組、amiHBV-4組和amiHBV 3-4組分別為71.6%、80.2%和79.7%。 4.在轉(zhuǎn)染后72h對細胞上清中HBsAg的抑制效果最好的為串聯(lián)序列組達到67.4%,其次為amiHBV-4組達到64.6%,再次為amiHBV-3組。對HBeAg的抑制總體效果不及對HBsAg的抑制效果好,串聯(lián)序列組抑制效果最好,但也只達到了31%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后兩組(amiHBV 3-4和amiHBV-4)對HBsAg和HBeAg的分泌,均顯示了顯著的抑制效果。對HBsAg的抑制率最高達97.18%,對HBeAg的抑制率最高達97.00%。 5.對HBV cccDNA的干擾情況進行了研究,瞬時轉(zhuǎn)染amiHBV-4組對HBV cccDNA的抑制率為21.9%,串聯(lián)序列amiHBV3-4組的抑制率(58.4%)明顯高于單一序列組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后串聯(lián)序列組HBV cccDNA的抑制率為99.65%,單一序列組的抑制率為93.78%。 結(jié)論： 1.分別靶向HBV S區(qū)基因256-276bp和672-692bp位點的單一序列amiRNA對HBV RNA、DNA和表面抗原(HBsAg)均有顯著的干擾效果。 2.同時靶向HBV S區(qū)基因256-276bp和672-692bp兩個位點的串聯(lián)序列amiRNA對HBV RNA、DNA和HBsAg的干擾效果均顯著優(yōu)于單一序列HBVamiRNA的干擾效果。 3.瞬時轉(zhuǎn)染靶向HBV S區(qū)的串聯(lián)序列amiRNA對HBsAg的抑制效果顯著,對HBeAg的抑制不明顯；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染串聯(lián)序列amiRNA對HBsAg和HBeAg均有顯著的抑制效果。 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單一序列或串聯(lián)序列amiRNA對HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均優(yōu)于瞬時轉(zhuǎn)染的抑制效果。 5.針對HBV S區(qū)基因的單一序列或串聯(lián)序列amiRNA對HBV RNA、表面抗原(HBsAg)、DNA及cccDNA均有較好的干擾效果,提示HBV S區(qū)基因是RNA干擾的有效靶點之一。 6.串聯(lián)序列amiRNA介導(dǎo)的RNA干擾機制能極大程度的抑制HBV的復(fù)制、病毒蛋白的表達及復(fù)制根源cccDNA。 7.本研究串聯(lián)兩個靶位點的amiRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建成功并顯示高效的抗病毒功能,提示針對多個靶基因或靶位點的amiRNA載體的構(gòu)建和功能的實現(xiàn)具有可行性。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

材料和方法一、材料(一)主要材料1.細胞株:HepG2.2.15細胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院繆曉輝院長惠贈，本室保存。2.感受態(tài)細菌Ecoll:購自天根生化科技(北京)有限公司。3.質(zhì)粒:peDNA6.2一G/W一EmGFP一miRNA質(zhì)粒表達載體購自Invitrogen公司。該載體為線性化質(zhì)粒，大小為5453bp，兩端含有連接位點(圖l)，其真核抗性為殺稻瘟素抗性，原核抗性為壯觀霉素。該質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白EmGFP基因，它和micro序列都在同一個CMV啟動子的啟動下表達的，可以很方便的示蹤質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達情況。miRNA陰性對照表達載體peDNA6.2一G/W一EmGFP一miRNA由美國hivitrogen公司提供，陰性對照插入的是無敲減效率的片段的miRNA(圖2)。miRNA相應(yīng)的DNA序列和各種PCR引物的合成均由上海銳賽生物技術(shù)有限公司合成。

G2.2.155513.367士Q.2522212.733土0.153330.6333330.6447772.193655555NNNCCC14.533出0.2088812刀67土0.252221.7667770.2939991.000000000lmV一111巧.500土0，3611113.233士0.321112，2667770.2078880.707111129.3%%%i王正V一22213.533土0.3511111.533士0.153332.0000000.2500000.850677714.9%%%il正V一33314.400士0.3611111.267士0.289993.1333330.1140000.387799961.2%%%illBV一44417屏67士04044413.667士0.252223.8000000.0718880.244299975.6%%%驗結(jié)果顯示:amiHBV一3和田拍HBV一4兩片段的干擾效應(yīng)最高，分別是61.2%%。:eal一timePCR中Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。圖中的抑制率是用3組觀測樣本來的。NC為對照組(negativeconiroD，干擾效率分別為各組與NC組的比較。大說明DNA復(fù)制需要的時間越長，故抑制率越高。這種計算方法是qPCR量的通用公式，公認的計算方法。

HBsAg和HBeAg檢測采用雅培試劑盒購于美國Abboutt公司，Axsym全自動免疫分析儀購自美國Abboutt公司，HBVDNA的檢測采用上海復(fù)星公司PCR實時熒光定量檢測試劑盒。其余實驗材料同第二部分。二、方法(一)HBVamiRNA串聯(lián)序列表達載體的構(gòu)建用B田nHI和勸of切下amiHBV一3重組質(zhì)粒中的插入片段(片段3)，用Bgl11和Xllol酶切線性化的amiHBV一4重組質(zhì)粒(片段4)，利用BamHI和Xhol同尾相連的原理將片段3與片段4連接，構(gòu)建串聯(lián)序列質(zhì)粒表達載體。技術(shù)路線見圖11翻.片段3..1片段4
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王衛(wèi)兵;干擾素與自身免疫病的關(guān)系研究進展[J];臨床薈萃;1997年21期

2 李謹革!710038西安,周永興!710038西安,連建奇!710038西安,馮志華!710038西安,賈戰(zhàn)生!710038西安;雙位點核酶抑制細胞內(nèi)乙型肝炎病毒表達的研究[J];中華內(nèi)科雜志;2000年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 羅祥基;HBS RNAi技術(shù)抑制HBV復(fù)制及肝癌細胞生長能力的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳常云;隱匿性乙型肝炎病毒感染：HBV基因變異分析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

本文編號：2880783