研究目的白介素-37(IL-37)是新發(fā)現(xiàn)的免疫負(fù)調(diào)控分子,它有5個亞型IL-37a-e,其中IL-37b是目前研究最多的,也是公認(rèn)的有功能的亞型,它作為抑制炎癥的分子,在很多疾病中都發(fā)揮重要的功能,例如,在內(nèi)毒素性休克、結(jié)腸炎、脊髓損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病模型中,IL-37b都對機(jī)體有保護(hù)作用。IL-37b發(fā)揮生物學(xué)功能主要依靠其C-端3個外顯子4、5、6形成有功能的β折疊結(jié)構(gòu),通過對IL-37其他亞型的基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),IL-37a和IL-37d同樣具有外顯子4、5、6,推測這兩個亞型也是具有功能的,而IL-37d比IL-37b僅缺少了一個外顯子2,但目前對于IL-37d的功能還沒有研究報道。為了進(jìn)一步探究IL-37d的生物學(xué)功能,我們實驗室構(gòu)建了 IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠,初步在內(nèi)毒素血癥模型證明IL-37d與IL-37b一樣具有抗炎作用,但在其他疾病中的作用和作用機(jī)制尚不清楚。近幾年的研究報道表明炎癥小體在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,特別是NLRP3炎癥小體,它的過度活化會加重多種疾病的嚴(yán)重程度,如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、肥胖病和結(jié)腸炎等。那么IL-37d是否可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體進(jìn)而抑制炎性疾病的發(fā)生?如果可以,它的作用機(jī)制如何?這些問題尚不清楚。本研究的目的就是探索IL-37d對NLRP3炎癥小體的調(diào)控及其機(jī)制;并利用轉(zhuǎn)基因小鼠,以DSS-結(jié)腸炎為模型探討了 IL-37d在炎性疾病中的作用。研究方法一、體外實驗證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響1.取野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎癥小體,用熒光定量PCR檢測IL-37表達(dá)對IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)的影響,ELISA的方法檢測IL-37表達(dá)對上清中IL-1β和IL-6分泌情況的影響,Western-blot檢測其對IL-1β蛋白表達(dá)的影響。2.取野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎癥小體,熒光定量PCR檢測IL-37d表達(dá)對NLRP3、caspase1、ASC各個組分mRNA水平表達(dá)的影響;Western-blot檢測炎癥小體NLRP3、pro-caspase1、ASC、caspase1p10各個組分蛋白水平的變化情況。二、體內(nèi)實驗證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響1.急性腹膜炎模型:向野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔中注射明礬700μg,12h后用PBS收取小鼠腹腔灌洗液,計數(shù)統(tǒng)計腹腔灌洗液中的細(xì)胞總數(shù);流式細(xì)胞術(shù)檢測灌洗液中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量。2.急性結(jié)腸炎模型:向野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠喂食4%葡聚糖硫酸鈉溶液7天,期間每日稱重,取小鼠糞便做大便潛血實驗,7日后,將小鼠摘除眼球取血,結(jié)腸拍照,體外定量培養(yǎng)結(jié)腸組織,收集上清,石蠟包埋結(jié)腸組織用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。三、IL-37d調(diào)控NLRP3炎癥小體活性的機(jī)制(一)IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠中IL-37d發(fā)揮作用的形式1.取野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,用LPS和ATP刺激,濃縮上清,western-blot檢測IL-37d分泌的形式。(二)IL-37d對NLRP3炎癥小體活性調(diào)控是否依賴于受體介導(dǎo)通路1.外源性重組IL-37d蛋白是否可抑制NLRP3的活化及沉默IL-37受體后對炎癥小體活化的影響。(1)原核表達(dá)IL-37d重組蛋白,純化蛋白后去內(nèi)毒素。(2)取野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,加入IL-37d重組蛋白,用LPS和ATP刺激,ELISA檢測上清中IL-1β的分泌情況,western-blot檢測NLRP3炎癥小體各個組分的蛋白水平。(3)取野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染IL-37d受體SIGIRR的小干擾,加入IL-37d重組蛋白,ELISA檢測上清中IL-1β的分泌情況,western-blot檢測NLRP3炎癥小體各個組分的蛋白水平。四、IL-37d調(diào)控NLRP3活性的信號通路1.取野生型小鼠和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,用LPS和ATP刺激Western-blot檢測NF-κB信號通路的改變。2.取野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,加入IL-37d重組蛋白,用LPS和ATP刺激,Western-blot檢測NF-κB信號通路的改變。結(jié)果一、IL-37d能夠下調(diào)NLRP3炎癥小體活化條件下IL-1β的分泌為了分析IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響,我們分別取野生型和IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,體外用LPS和LPS+ATP活化炎癥小體,熒光定量PCR、Western Blot和ELISA的方法分析IL-37d對NLRP3炎癥小體活化條件下IL-1β表達(dá)的影響,同時以IL-6作為對照。結(jié)果顯示IL-37d能抑制LPS刺激后IL-6mRNA的表達(dá)水平,ATP的加入沒有進(jìn)一步影響其表達(dá)水平。但是不管在LPS刺激還是LPS+ATP調(diào)節(jié)下,IL-37d對IL-1β的mRNA水平均無明顯影響并且Western-blot結(jié)果顯示IL-37d對IL-1β前體的表達(dá)也無明顯影響。然而ELISA結(jié)果顯示,在加入LPS刺激時,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-1β的分泌與野生型小鼠差別不大,且分泌量都很低;但在同時加入LPS和NLRP3炎癥小體激動劑ATP后,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中IL-1β的分泌明顯少于野生型小鼠。我們同時還檢測了 IL-6的分泌,因為IL-6的分泌并不依賴于炎癥小體的活化,所以IL-37d對IL-6的抑制作用并沒有隨著NLRP3炎癥小體激動劑ATP的加入而改變。這些結(jié)果證明IL-37d對IL-1β的抑制是通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的活性。二、IL-37d下調(diào)NLRP3炎癥小體組分NLRP3的表達(dá)為了進(jìn)一步研究IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響,我們用熒光定量PCR和Western Blot的方法進(jìn)一步分析了 IL-37d對NLRP3炎癥小體各組分的影響。結(jié)果顯示,IL-37d可明顯下調(diào)NLRP3的mRNA的表達(dá),但對其他組分影響不大。進(jìn)一步Western-blot結(jié)果顯示,在LPS刺激時,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的NLRP3蛋白表達(dá)量明顯低于野生型小鼠,在LPS和ATP同時刺激時Caspase1的活性形式p10,也有降低的趨勢,證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的活性有抑制作用,并提示IL-37d主要是通過抑制NLRP3表達(dá)進(jìn)而抑制炎癥小體的活化。三、IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗炎癥小體誘發(fā)的急性腹膜炎為了進(jìn)一步確定IL-37d對炎癥小體的活性的影響,我們利用轉(zhuǎn)基因小鼠和明礬誘導(dǎo)的急性腹膜炎模型,在體內(nèi)分析了 IL-37d對炎癥小體的影響,我們發(fā)現(xiàn)IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和單核細(xì)胞數(shù)都明顯低于野生型,說明IL-37d可抑制炎癥小體介導(dǎo)的急性腹膜炎。四、IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗DSS誘導(dǎo)的炎癥小體活化的急性結(jié)腸炎已知NLRP3炎癥小體的過度活化參與急性結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展,為了確定IL-37d是否可通過抑制炎癥小體的活化抑制結(jié)腸炎,我們利用轉(zhuǎn)基因小鼠和DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型,在體內(nèi)分析了 IL-37d對炎癥小體的影響及其對結(jié)腸炎的影響。結(jié)果顯示在急性結(jié)腸炎模型中,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的血清和腸培養(yǎng)物上清中的IL-1β相比于野生型小鼠都有下降的趨勢,且血清中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)腸組織NLRP3蛋白的表達(dá)量要少于野生型小鼠。同時,HE染色結(jié)果顯示IL-37d改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸黏膜的損傷、減少炎性細(xì)胞的浸潤。結(jié)腸長度統(tǒng)計結(jié)果表明,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸比野生型小鼠的長,且有統(tǒng)計學(xué)意義。對急性結(jié)腸炎模型小鼠7天的體重下降百分?jǐn)?shù)和疾病活躍指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計,結(jié)果表明,IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠體重下降百分?jǐn)?shù)高于野生型小鼠,疾病活躍指數(shù)低于野生型,且都有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果說明IL-37d抑制炎癥小體的過度活化及減輕結(jié)腸炎程度。五、IL-37d對NLRP3炎癥小體的作用機(jī)制為了探究IL-37d對NLRP3炎癥小體的作用機(jī)制,我們想先明確IL-37d發(fā)揮作用的形式。我們?nèi)L-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,在LPS和ATP同時刺激的情況下,收集并濃縮其上清,western-blot結(jié)果顯示,上清中包含IL-37d的成熟形式和前體形式。確定IL-37d在胞外發(fā)揮作用后,我們原核表達(dá)IL-37d,純化蛋白后,用于體外實驗。ELISA和western-blot結(jié)果顯示,相比于不加重組蛋白的野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,IL-37d重組蛋白可以抑制NLRP3炎癥小體活化產(chǎn)生的IL-1β的分泌,同時也能夠抑制NLRP3蛋白的表達(dá)及NF-κB的活性。結(jié)果提示IL-37d是通過胞膜受體依賴的方式發(fā)揮抑制作用。為了進(jìn)一步確定IL-37d是通過受體介導(dǎo)的信號通路發(fā)揮作用,我們在野生型小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IL-37d受體SIGIRR的小干擾,ELISA結(jié)果顯示,沉默IL-37d受體表達(dá)后,IL-37d對IL-1β的抑制作用消失,western-blot的結(jié)果顯示,IL-37d對NLRP3蛋白及NF-κB的抑制作用也消失。說明IL-37d對NLRP3炎癥小體活性的抑制是通過受體介導(dǎo)的信號通路,抑制NLRP3蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)的。結(jié)論1.IL-37d能夠抑制NLRP3炎癥小體的活性,從而可以下調(diào)由NLRP3炎癥小體活化產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-1β的分泌,進(jìn)而緩解結(jié)腸炎。2.IL-37d對NLRP3炎癥小體活性的抑制是通過受體介導(dǎo)的信號通路,抑制NLRP3蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)的。創(chuàng)新性及意義1.本研究首次提出,IL-37d作為IL-37的一種亞型,是具有生物學(xué)功能的亞型,具有免疫抑制作用,能夠抑制失控的炎癥反應(yīng),從而緩解結(jié)腸炎,為治療炎癥性疾病提供了新的靶點。2.本研究還對IL-37d發(fā)揮抑制作用的機(jī)制做了闡述,它可以通過受體介導(dǎo)的信號通路,抑制NLRP3炎癥小體的過度活化,從而抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β的分泌。結(jié)合之前的文獻(xiàn)報道,IL-37的成熟需要NLRP3炎癥小體活化的caspasel切割,我們發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體和IL-37d之間可以形成環(huán)路,這也是機(jī)體維持免疫平衡的表現(xiàn)。局限性1.本研究只是在轉(zhuǎn)基因小鼠層面進(jìn)行研究,并沒有結(jié)合臨床標(biāo)本,想要將其應(yīng)用到臨床,還需要結(jié)合臨床標(biāo)本進(jìn)一步研究。2.本研究IL-37d抑制炎癥小體的詳細(xì)機(jī)制還需要做更多的工作進(jìn)一步確定其結(jié)論。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１隨后通過ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用與ＡＳＣ結(jié)合，使得??ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１的蛋白水解激活，形成有活性的ｃａｓｐａｓｅｌ，切割ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的??前體［９］（圖１）。??１７??

３會在胞外被切割。ＩＬ－３７ａ，ｂ和ｄ都包含外顯子４，?５，?６，因此都可以編碼有功??能的蛋白。幾－３７〇和６缺少一個或多個外顯子，很可能編碼沒有功能的蛋白。??ＩＬ－３７ｂ是表達(dá)和研究最多的，最近的報道也都關(guān)注這個亞型（圖２）。??編碼ＩＬ－３７的基因，在人２號染色體長臂１區(qū)２帶到１區(qū)３帶，作為ＩＬ－１??家族基因簇中的一部分，非常接近ＩＬ－ｌａ和ＩＬ－ｌｐ基因調(diào)控區(qū)［３１］。這種定位對??于ＩＬ－３７作為一個炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)分子來說十分重要。當(dāng)促炎信號誘導(dǎo)ＩＬ＿ｌａ和??ＩＬ－１Ｐ基因轉(zhuǎn)錄時，ＩＬ－３７也會被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，限制過度有害的炎癥。??人ＩＬ－３７的基因在小鼠中并不存在。雖然小鼠體內(nèi)存在ＩＬ－３７的第一個外顯??子，但是并沒有開放讀碼框。不同的進(jìn)化途徑是不同病原體選擇的結(jié)果，最終導(dǎo)??致小鼠體內(nèi)沒有ＩＬ－３７基因。出乎意料的是，在進(jìn)化上與人基因簇接近的兩個物??種，猿和黑猩猩，也都沒有編碼ＩＬ－３７的基因，然而在大猩猩和靈長類動物中存??在ＩＬ－３７的基因［３２］。一個可能的解釋是小鼠和黑猩猩體內(nèi)傳統(tǒng)的ｉｌ－３７基因被??內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄病毒破壞。??１?Ｉｓｏｆｏｒｍ?Ｅｘｏｎｓ?Ｒｅｓｉｄｕｅｓ??ＩＩ?．???■■■■＿，■■丫??

細(xì)？??（５－Ａｃｔｉｎ丨曬曬曬丨■?■?＾－＾＿丨丨丨，曬—■■??圖１．２?ＩＬ－３７ｄ對ＩＬ－ｉｐ前體形式蛋白表達(dá)的影響??Ｆｉｇｕｒｅｌ．２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏ
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