研究目的白介素-37(IL-37)是新發(fā)現的免疫負調控分子,它有5個亞型IL-37a-e,其中IL-37b是目前研究最多的,也是公認的有功能的亞型,它作為抑制炎癥的分子,在很多疾病中都發(fā)揮重要的功能,例如,在內毒素性休克、結腸炎、脊髓損傷、類風濕性關節(jié)炎等炎癥性疾病模型中,IL-37b都對機體有保護作用。IL-37b發(fā)揮生物學功能主要依靠其C-端3個外顯子4、5、6形成有功能的β折疊結構,通過對IL-37其他亞型的基因結構分析發(fā)現,IL-37a和IL-37d同樣具有外顯子4、5、6,推測這兩個亞型也是具有功能的,而IL-37d比IL-37b僅缺少了一個外顯子2,但目前對于IL-37d的功能還沒有研究報道。為了進一步探究IL-37d的生物學功能,我們實驗室構建了 IL-37d轉基因小鼠,初步在內毒素血癥模型證明IL-37d與IL-37b一樣具有抗炎作用,但在其他疾病中的作用和作用機制尚不清楚。近幾年的研究報道表明炎癥小體在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,特別是NLRP3炎癥小體,它的過度活化會加重多種疾病的嚴重程度,如2型糖尿病、動脈粥樣硬化、肥胖病和結腸炎等。那么IL-37d是否可通過調控NLRP3炎癥小體進而抑制炎性疾病的發(fā)生?如果可以,它的作用機制如何?這些問題尚不清楚。本研究的目的就是探索IL-37d對NLRP3炎癥小體的調控及其機制;并利用轉基因小鼠,以DSS-結腸炎為模型探討了 IL-37d在炎性疾病中的作用。研究方法一、體外實驗證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響1.取野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎癥小體,用熒光定量PCR檢測IL-37表達對IL-1β和IL-6的mRNA表達的影響,ELISA的方法檢測IL-37表達對上清中IL-1β和IL-6分泌情況的影響,Western-blot檢測其對IL-1β蛋白表達的影響。2.取野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞,用LPS和ATP刺激活化NLRP3炎癥小體,熒光定量PCR檢測IL-37d表達對NLRP3、caspase1、ASC各個組分mRNA水平表達的影響;Western-blot檢測炎癥小體NLRP3、pro-caspase1、ASC、caspase1p10各個組分蛋白水平的變化情況。二、體內實驗證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響1.急性腹膜炎模型:向野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠的腹腔中注射明礬700μg,12h后用PBS收取小鼠腹腔灌洗液,計數統(tǒng)計腹腔灌洗液中的細胞總數;流式細胞術檢測灌洗液中中性粒細胞和單核細胞的數量。2.急性結腸炎模型:向野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠喂食4%葡聚糖硫酸鈉溶液7天,期間每日稱重,取小鼠糞便做大便潛血實驗,7日后,將小鼠摘除眼球取血,結腸拍照,體外定量培養(yǎng)結腸組織,收集上清,石蠟包埋結腸組織用于HE染色和免疫組織化學染色。三、IL-37d調控NLRP3炎癥小體活性的機制(一)IL-37d轉基因小鼠中IL-37d發(fā)揮作用的形式1.取野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞,用LPS和ATP刺激,濃縮上清,western-blot檢測IL-37d分泌的形式。(二)IL-37d對NLRP3炎癥小體活性調控是否依賴于受體介導通路1.外源性重組IL-37d蛋白是否可抑制NLRP3的活化及沉默IL-37受體后對炎癥小體活化的影響。(1)原核表達IL-37d重組蛋白,純化蛋白后去內毒素。(2)取野生型小鼠的腹腔巨噬細胞,加入IL-37d重組蛋白,用LPS和ATP刺激,ELISA檢測上清中IL-1β的分泌情況,western-blot檢測NLRP3炎癥小體各個組分的蛋白水平。(3)取野生型小鼠的腹腔巨噬細胞,轉染IL-37d受體SIGIRR的小干擾,加入IL-37d重組蛋白,ELISA檢測上清中IL-1β的分泌情況,western-blot檢測NLRP3炎癥小體各個組分的蛋白水平。四、IL-37d調控NLRP3活性的信號通路1.取野生型小鼠和IL-37d轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞,用LPS和ATP刺激Western-blot檢測NF-κB信號通路的改變。2.取野生型小鼠的腹腔巨噬細胞,加入IL-37d重組蛋白,用LPS和ATP刺激,Western-blot檢測NF-κB信號通路的改變。結果一、IL-37d能夠下調NLRP3炎癥小體活化條件下IL-1β的分泌為了分析IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響,我們分別取野生型和IL-37d轉基因小鼠腹腔巨噬細胞,體外用LPS和LPS+ATP活化炎癥小體,熒光定量PCR、Western Blot和ELISA的方法分析IL-37d對NLRP3炎癥小體活化條件下IL-1β表達的影響,同時以IL-6作為對照。結果顯示IL-37d能抑制LPS刺激后IL-6mRNA的表達水平,ATP的加入沒有進一步影響其表達水平。但是不管在LPS刺激還是LPS+ATP調節(jié)下,IL-37d對IL-1β的mRNA水平均無明顯影響并且Western-blot結果顯示IL-37d對IL-1β前體的表達也無明顯影響。然而ELISA結果顯示,在加入LPS刺激時,IL-37d轉基因小鼠腹腔巨噬細胞上清中IL-1β的分泌與野生型小鼠差別不大,且分泌量都很低;但在同時加入LPS和NLRP3炎癥小體激動劑ATP后,IL-37d轉基因小鼠腹腔巨噬細胞上清中IL-1β的分泌明顯少于野生型小鼠。我們同時還檢測了 IL-6的分泌,因為IL-6的分泌并不依賴于炎癥小體的活化,所以IL-37d對IL-6的抑制作用并沒有隨著NLRP3炎癥小體激動劑ATP的加入而改變。這些結果證明IL-37d對IL-1β的抑制是通過調控NLRP3炎癥小體的活性。二、IL-37d下調NLRP3炎癥小體組分NLRP3的表達為了進一步研究IL-37d對NLRP3炎癥小體的影響,我們用熒光定量PCR和Western Blot的方法進一步分析了 IL-37d對NLRP3炎癥小體各組分的影響。結果顯示,IL-37d可明顯下調NLRP3的mRNA的表達,但對其他組分影響不大。進一步Western-blot結果顯示,在LPS刺激時,IL-37d轉基因小鼠腹腔巨噬細胞中的NLRP3蛋白表達量明顯低于野生型小鼠,在LPS和ATP同時刺激時Caspase1的活性形式p10,也有降低的趨勢,證明IL-37d對NLRP3炎癥小體的活性有抑制作用,并提示IL-37d主要是通過抑制NLRP3表達進而抑制炎癥小體的活化。三、IL-37d轉基因小鼠抵抗炎癥小體誘發(fā)的急性腹膜炎為了進一步確定IL-37d對炎癥小體的活性的影響,我們利用轉基因小鼠和明礬誘導的急性腹膜炎模型,在體內分析了 IL-37d對炎癥小體的影響,我們發(fā)現IL-37d轉基因小鼠腹腔灌洗液中的細胞總數、中性粒細胞數和單核細胞數都明顯低于野生型,說明IL-37d可抑制炎癥小體介導的急性腹膜炎。四、IL-37d轉基因小鼠抵抗DSS誘導的炎癥小體活化的急性結腸炎已知NLRP3炎癥小體的過度活化參與急性結腸炎的發(fā)生和發(fā)展,為了確定IL-37d是否可通過抑制炎癥小體的活化抑制結腸炎,我們利用轉基因小鼠和DSS誘導的急性結腸炎模型,在體內分析了 IL-37d對炎癥小體的影響及其對結腸炎的影響。結果顯示在急性結腸炎模型中,IL-37d轉基因小鼠的血清和腸培養(yǎng)物上清中的IL-1β相比于野生型小鼠都有下降的趨勢,且血清中的差異有統(tǒng)計學意義。免疫組織化學結果顯示,IL-37d轉基因小鼠結腸組織NLRP3蛋白的表達量要少于野生型小鼠。同時,HE染色結果顯示IL-37d改善DSS誘導的結腸黏膜的損傷、減少炎性細胞的浸潤。結腸長度統(tǒng)計結果表明,IL-37d轉基因小鼠的結腸比野生型小鼠的長,且有統(tǒng)計學意義。對急性結腸炎模型小鼠7天的體重下降百分數和疾病活躍指數進行統(tǒng)計,結果表明,IL-37d轉基因小鼠體重下降百分數高于野生型小鼠,疾病活躍指數低于野生型,且都有統(tǒng)計學意義。上述結果說明IL-37d抑制炎癥小體的過度活化及減輕結腸炎程度。五、IL-37d對NLRP3炎癥小體的作用機制為了探究IL-37d對NLRP3炎癥小體的作用機制,我們想先明確IL-37d發(fā)揮作用的形式。我們取IL-37d轉基因小鼠的腹腔巨噬細胞,在LPS和ATP同時刺激的情況下,收集并濃縮其上清,western-blot結果顯示,上清中包含IL-37d的成熟形式和前體形式。確定IL-37d在胞外發(fā)揮作用后,我們原核表達IL-37d,純化蛋白后,用于體外實驗。ELISA和western-blot結果顯示,相比于不加重組蛋白的野生型小鼠的腹腔巨噬細胞,IL-37d重組蛋白可以抑制NLRP3炎癥小體活化產生的IL-1β的分泌,同時也能夠抑制NLRP3蛋白的表達及NF-κB的活性。結果提示IL-37d是通過胞膜受體依賴的方式發(fā)揮抑制作用。為了進一步確定IL-37d是通過受體介導的信號通路發(fā)揮作用,我們在野生型小鼠的腹腔巨噬細胞中轉染IL-37d受體SIGIRR的小干擾,ELISA結果顯示,沉默IL-37d受體表達后,IL-37d對IL-1β的抑制作用消失,western-blot的結果顯示,IL-37d對NLRP3蛋白及NF-κB的抑制作用也消失。說明IL-37d對NLRP3炎癥小體活性的抑制是通過受體介導的信號通路,抑制NLRP3蛋白的表達來實現的。結論1.IL-37d能夠抑制NLRP3炎癥小體的活性,從而可以下調由NLRP3炎癥小體活化產生的促炎細胞因子IL-1β的分泌,進而緩解結腸炎。2.IL-37d對NLRP3炎癥小體活性的抑制是通過受體介導的信號通路,抑制NLRP3蛋白的表達來實現的。創(chuàng)新性及意義1.本研究首次提出,IL-37d作為IL-37的一種亞型,是具有生物學功能的亞型,具有免疫抑制作用,能夠抑制失控的炎癥反應,從而緩解結腸炎,為治療炎癥性疾病提供了新的靶點。2.本研究還對IL-37d發(fā)揮抑制作用的機制做了闡述,它可以通過受體介導的信號通路,抑制NLRP3炎癥小體的過度活化,從而抑制促炎細胞因子IL-1β的分泌。結合之前的文獻報道,IL-37的成熟需要NLRP3炎癥小體活化的caspasel切割,我們發(fā)現NLRP3炎癥小體和IL-37d之間可以形成環(huán)路,這也是機體維持免疫平衡的表現。局限性1.本研究只是在轉基因小鼠層面進行研究,并沒有結合臨床標本,想要將其應用到臨床,還需要結合臨床標本進一步研究。2.本研究IL-37d抑制炎癥小體的詳細機制還需要做更多的工作進一步確定其結論。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

Ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１隨后通過ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用與ＡＳＣ結合，使得??ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１的蛋白水解激活，形成有活性的ｃａｓｐａｓｅｌ，切割ＩＬ－ｉｐ和ＩＬ－１８的??前體［９］（圖１）。??１７??

３會在胞外被切割。ＩＬ－３７ａ，ｂ和ｄ都包含外顯子４，?５，?６，因此都可以編碼有功??能的蛋白。幾－３７〇和６缺少一個或多個外顯子，很可能編碼沒有功能的蛋白。??ＩＬ－３７ｂ是表達和研究最多的，最近的報道也都關注這個亞型（圖２）。??編碼ＩＬ－３７的基因，在人２號染色體長臂１區(qū)２帶到１區(qū)３帶，作為ＩＬ－１??家族基因簇中的一部分，非常接近ＩＬ－ｌａ和ＩＬ－ｌｐ基因調控區(qū)［３１］。這種定位對??于ＩＬ－３７作為一個炎癥反應的調節(jié)分子來說十分重要。當促炎信號誘導ＩＬ＿ｌａ和??ＩＬ－１Ｐ基因轉錄時，ＩＬ－３７也會被誘導轉錄，限制過度有害的炎癥。??人ＩＬ－３７的基因在小鼠中并不存在。雖然小鼠體內存在ＩＬ－３７的第一個外顯??子，但是并沒有開放讀碼框。不同的進化途徑是不同病原體選擇的結果，最終導??致小鼠體內沒有ＩＬ－３７基因。出乎意料的是，在進化上與人基因簇接近的兩個物??種，猿和黑猩猩，也都沒有編碼ＩＬ－３７的基因，然而在大猩猩和靈長類動物中存??在ＩＬ－３７的基因［３２］。一個可能的解釋是小鼠和黑猩猩體內傳統(tǒng)的ｉｌ－３７基因被??內源的逆轉錄病毒破壞。??１?Ｉｓｏｆｏｒｍ?Ｅｘｏｎｓ?Ｒｅｓｉｄｕｅｓ??ＩＩ?．???■■■■＿，■■丫??

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