發(fā)布時(shí)間：2020-11-11 02:58

　　 目的:探討乳脂球表皮生長(zhǎng)因子-8(milk fat globule-epidermal growth factor-8,MFG-E8)在非酒精脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)中的作用及其潛在機(jī)制。方法:將24只野生型(wild type,WT)和MFG-E8基因敲除(knock out,KO)C57BL/6小鼠隨機(jī)分成4組(CD-WT組、MCD-WT組、CD-KO組和MCD-KO組)。其中CD-WT組和CD-KO組給予對(duì)照飼料(control diet,CD)飲食;MCD-WT組和MCD-KO組給予蛋氨酸和膽堿缺乏模型飼料(methionine and choline deficient diet,MCD)飲食。期間密切觀察小鼠身體狀態(tài),并每周固定時(shí)間測(cè)量記錄其體重。5周后收取小鼠血液和肝臟組織。試劑盒檢測(cè)血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,AST)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性水平,肝臟組織中的甘油三酯(triglyceride,TG)含量;蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色檢測(cè)評(píng)估肝臟病理學(xué)變化;油紅O染色評(píng)價(jià)肝臟脂肪變性程度;天狼星紅和馬森三色染色評(píng)估肝臟纖維化程度;免疫熒光染色檢測(cè)肝臟中巨噬細(xì)胞(F4/80)和中性粒細(xì)胞(Ly6G)募集和浸潤(rùn)情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-lineked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)肝組織中細(xì)胞因子TNF-?和IL-1?蛋白的表達(dá);實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitatative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-?細(xì)胞因子mRNA的表達(dá);免疫蛋白印跡法(western blot,WB)檢測(cè)肝臟組織中TLR4信號(hào)通路中TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.與CD-WT組相比,MCD-WT組小鼠血清中ALT、AST的活性水平、肝組織TG含量顯著增高,肝臟病理損傷和脂肪變性、肝臟纖維化程度加重,肝臟巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增加,肝組織內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β蛋白及TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-βmRNA的表達(dá)增多,TLR4相關(guān)通路TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65蛋白的表達(dá)上調(diào)。2.與MCD-WT組相比,MCD-KO組小鼠血清ALT、AST的活性水平及肝組織TG含量增高,肝臟脂肪變性、纖維化程度加重,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)增加,細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-βmRNA的表達(dá)均上調(diào),TLR4通路TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65等相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。結(jié)論:MFG-E8基因敲除促進(jìn)非酒精脂肪性肝炎的發(fā)展,這可能與其增加炎癥細(xì)胞因子的釋放,增加炎性細(xì)胞的的浸潤(rùn),活化TLR4信號(hào)相關(guān)通路,擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

1.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以 X ±SD來表示，采用單因素方差分析或 t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， p＜ 0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 MFG-E8 基因敲除增加 NASH 小鼠血清中 ALT 和 AST 的活性血清 ALT 和 AST 活性是評(píng)價(jià)肝臟功能損傷的指標(biāo)，如圖 1 所示，與 CD-WT組相比，MCD-WT 組小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性水平顯著增加（p＜0.01）。與 MCD-WT 組相比，MCD 組小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性水平顯著增加（p＜0.01）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.2 MFG-E8 基因敲除加重 NASH 小鼠肝臟的病理學(xué)損傷如圖 2A HE 染色結(jié)果所示， CD-WT 組和 CD-KO 組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉完整，肝板正常，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈條索狀排列。與 CD-WT 組相比，MCD-WT 小鼠肝臟組織肝小葉完整性被破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，大部分肝細(xì)胞核被擠到細(xì)胞邊緣呈明顯的空泡狀，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與MCD-WT組相比，MCD-KO 組小鼠脂肪空泡更大更多，炎癥細(xì)胞大多匯聚在匯管區(qū)，有的可見炎癥細(xì)胞團(tuán)凝集，胞漿疏松化更嚴(yán)重。如圖2B NAS評(píng)分所示，與CD-WT組相比，MCD-WT 脂肪變性、炎癥和氣球樣變加重，通過 NAS 評(píng)分系統(tǒng)的可得出MCD-WT 組小鼠已患 NASH。與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組小鼠脂肪變性、炎癥和氣球樣變更嚴(yán)重，通過 NAS 評(píng)分系統(tǒng)的可得出 MCD-KO 更加嚴(yán)重。

圖 3.MFG-E8 加重 NASH 小鼠肝臟脂肪變性Fig 3. MFG-E8 aggravates hepatic steatosis in NASH miceO 染色結(jié)果×200 B: 肝 TG 水平（與 CD-WT 相比##P＜0.01 ，與 MCD相比**P＜0.01）G-E8 基因敲除加重 NASH 小鼠肝臟的纖維化4A，馬森三色染色所示，與CD-WT組相比，MCD-WT組小鼠肝臟增加，紅色胞漿減少，與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組小鼠膠原更多紅色胞漿減少。如圖 4B，天狼星紅染色所示，與 CD-WT 組相T 組小鼠肝臟紅色膠原纖維增加，與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組纖維染色更多，圖中也可看出脂肪空泡增多。
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本文編號(hào)：2878654