研究背景:近年來(lái)潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)在我國(guó)發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。維生素D(VitaminD,VitD)和IBD的關(guān)系也日益受到學(xué)者的關(guān)注。VitD除調(diào)節(jié)鈣、磷代謝外,對(duì)人體還具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用。流行病學(xué)及國(guó)內(nèi)外臨床研究發(fā)現(xiàn)UC患者中VitD缺乏發(fā)生率高。但VitD預(yù)防UC尚處于探索階段,其在分子水平拮抗UC的機(jī)制也尚未完全明了�；|(zhì)Gla蛋白(MatrixGlaProtein,MGP)是首個(gè)報(bào)道的血管和軟骨鈣化抑制劑,已知活性維生素D可以直接調(diào)節(jié)MGP表達(dá),MGP蛋白作為一種基質(zhì)成分,在鈣磷代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。但MGP蛋白與UC發(fā)病的關(guān)系尚未可知,也未見(jiàn)報(bào)道。研究目的:(1)探究MGP蛋白在UC發(fā)病過(guò)程中mRNA和蛋白表達(dá)改變及作用;(2)探討MGP蛋白的上游調(diào)控通路和下游通路,及其可能的功能。方法:分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化法檢測(cè)MGP mRNA和蛋白在UC患者病變結(jié)腸黏膜和健康對(duì)照者結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)。C57BL/6小鼠給予含不同濃度(分別為2%、2.5%、3%)葡聚糖硫酸鈉(DSS)以建立急性結(jié)腸炎模型(對(duì)照組n=5,不同DSS組n分別為5、9、6),造模后第9天處死小鼠后評(píng)價(jià)結(jié)腸大體和病理炎癥,免疫組化和westernblot法檢測(cè)病變結(jié)腸黏膜中差異表達(dá)的MGP蛋白的水平。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MGP可能受到早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(Egr1)及p38-MAPK-JNK通路調(diào)節(jié),westernblot法檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜中Egr1、p38、磷酸化p38(p-p38)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)水平,以及黏膜屏障相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、E-cadherin和腸三葉因子TFF3水平,分析其與MGP蛋白之間的相關(guān)性。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Egr1對(duì)MGP基因啟動(dòng)子區(qū)活性的影響。脂多糖LPS刺激DLD-1細(xì)胞,建立體外炎性細(xì)胞模型,染色質(zhì)免疫沉淀法(CHIP)檢測(cè)Egr1與MGP基因啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合。構(gòu)建MGP過(guò)表達(dá)慢病毒載體,感染結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2和DLD1,嘌呤霉素篩選得到MGP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,westernblot檢測(cè)E-cadherin蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1.MGPmRNA在UC患者(n=50)腸黏膜中的表達(dá)較健康對(duì)照組(n=17)明顯升高,在重度UC患者中的表達(dá)水平高于輕中度UC患者(8.33±0.63 vs 3.87±0.35vs1.95±0.06,P0.01)。2.免疫組化結(jié)果顯示,MGP蛋白主要位于UC患者結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的胞漿內(nèi),正常結(jié)腸黏膜內(nèi)未見(jiàn)明顯表達(dá)。2.DSS模型組小鼠體重下降明顯,病理炎癥評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P0.01)。隨著DSS濃度增加,小鼠結(jié)腸炎癥加重,MGP的表達(dá)水平也呈逐漸升高趨勢(shì),均明顯高于對(duì)照組小鼠。3.模型組小鼠結(jié)腸組織中Egr-1、p38、p-p38、JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)均高于正常對(duì)照組小鼠(P0.01),與MGP的表達(dá)變化呈正相關(guān)性。E-cadherin、occludin、TFF3蛋白的表達(dá)低于對(duì)照組小鼠(P0.01),與MGP的表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)。4.轉(zhuǎn)錄因子Egr-1顯著增強(qiáng)MGP啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。5.脂多糖LPS刺激DLD-1細(xì)胞成功建立體外炎性細(xì)胞模型,CHIP結(jié)果顯示Egr1在MGP啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合明顯增高。6.成功構(gòu)建MGP過(guò)表達(dá)慢病毒載體,感染Caco2和DLD1細(xì)胞后得到MGP穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,MGPmRNA水平升高。E-cadherin蛋白表達(dá)較對(duì)照組細(xì)胞下降。結(jié)論:MGP蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)升高,受到轉(zhuǎn)錄因子Egr-1及p38-MAPK-JNK通路的調(diào)控,可能通過(guò)影響腸道黏膜屏障參與腸道炎癥發(fā)病機(jī)制。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R574.62
【部分圖文】：

動(dòng)組明顯高于對(duì)照組、緩解組、輕度活動(dòng)組和中度活動(dòng)組，分別為７．?９３倍、５．４８??倍、４．?２７倍和２．１５倍（Ｐ均＜０．０１）。在對(duì)照組和緩解組、輕度活動(dòng)組之間差異無(wú)??統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖２和表１１）。??ＭＧＰ??＜?＊＊??ｚ?１５－｜????＊＊??ｆ?：??Ｑ．????〇?？？??￥?１０－?：？??Ｉ?Ｔ?ｆ??＜Ｄ?？??Ｉ?５＂?總？??Ｉ?—令▼?▼▼??｜?〇?Ｉ??１?１?１?１—??／Ｖ?＃?／?／??ｉｆ?令??圖２?ＵＣ患者和對(duì)照者結(jié)腸黏膜組織中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表達(dá)情況??注：ｃｏｎｔｒｏｌ：對(duì)照組，ｎ＝１７；?ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：緩解組，ｎ?＝?７；?ｍｉｌｄ：輕度活動(dòng)組ｎ??＝?１３；?ｍｏｄｅｒａｔｅ：中度活動(dòng)組ｎ＝?１７；?ｓｅｖｅｒｅ：重度活動(dòng)組ｎ?＝?１３。采用方差分析??（ＡＮ０ＶＡ），各組數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤（又土ＳＥＭ）表示。材／ＸＯ．?０１。??表１１?ＵＣ患者和對(duì)照者結(jié)腸黏膜組織中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表達(dá)情況??分組?例數(shù)?ＭＧＰ?ｍＲＮＡ相與健康對(duì)照與緩解組與輕度活??（ｎ）?對(duì)表達(dá)?組比較?比較?動(dòng)組比較??對(duì)照組?１７?１．０５±０．１２?—?—?—??緩解組?７?Ｌ?５２?±０．０３?Ｐ＝０．４０９??輕度活動(dòng)組?１３?１．９５±０．０６?Ｐ＝Ｑ．?０６０?Ｐ＝０．４７９??中度活動(dòng)組?ｎ?３．８７±０．３５?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１??重度活動(dòng)組?１３?８．?３３±０．?６３?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１??注：采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）

免疫組化法檢測(cè)重度ＵＣ患者（ｎ＝９）和對(duì)照組（ｎ＝６）結(jié)腸黏膜中ＭＧＰ蛋白??的表達(dá)情況。ＭＧＰ蛋白表達(dá)于ＵＣ患者結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在對(duì)??照者結(jié)腸黏膜中染色較弱或未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)（圖３）。按照著色程度及陽(yáng)性細(xì)胞??數(shù)量乘積得分進(jìn)行評(píng)分后取平均值（詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法６．免疫組織化學(xué)染色），ＵＣ患??者組ＭＧＰ蛋白相對(duì)表達(dá)量（２．?８９?±０．４２）顯著高于健康對(duì)照組（０．６７±０．２１），差??異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｔ＝４．?０３，００１）（圖４和表１２）。??圖＿??？?人．’?？?．?＇■?：＇?？?ｔ?＊＊？．?＜?＃?－．ｖ－１?？?＊，?＊??＾?Ｄ??Ｂ．?－?Ｄ＇??圖３免疫組化檢測(cè)ＵＣ患者及對(duì)照組結(jié)腸黏膜中ＭＧＰ蛋白的表達(dá)情況??注：Ａ：對(duì)照組結(jié)腸黏膜病理Ｈ＆Ｅ染色（１００Ｘ）?；?Ｂ：對(duì)照組結(jié)腸黏膜ＭＧＰ蛋白免疫??組化染色未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（１００Ｘ）?；?Ｃ

１．不同濃度ＤＳＳ模型小鼠模型的建立：??模型組小鼠第３—５天開(kāi)始出現(xiàn)大便不成形、肉眼血便等結(jié)腸炎癥狀，同時(shí)伴有??體重下降、活動(dòng)減少、毛發(fā)色澤變差，體重變化情況如圖４所示。隨著ＤＳＳ濃度（濃??度分別為２％、２．５％、３％）的增高，上述癥狀越明顯。癥狀最重多出現(xiàn)于第７?—８天，??表現(xiàn)為排便無(wú)糞質(zhì)僅有鮮血，或反復(fù)刺激小鼠排便后僅能排出少量粘液，此時(shí)體重??亦降至最低。２．５％ＤＳＳ組小鼠于第８天死亡１只，３％ＤＳＳ組于第７天、第８天各死亡２??只。??２５??
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