研究背景:近年來潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)在我國發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。維生素D(VitaminD,VitD)和IBD的關(guān)系也日益受到學者的關(guān)注。VitD除調(diào)節(jié)鈣、磷代謝外,對人體還具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)等作用。流行病學及國內(nèi)外臨床研究發(fā)現(xiàn)UC患者中VitD缺乏發(fā)生率高。但VitD預防UC尚處于探索階段,其在分子水平拮抗UC的機制也尚未完全明了。基質(zhì)Gla蛋白(MatrixGlaProtein,MGP)是首個報道的血管和軟骨鈣化抑制劑,已知活性維生素D可以直接調(diào)節(jié)MGP表達,MGP蛋白作為一種基質(zhì)成分,在鈣磷代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。但MGP蛋白與UC發(fā)病的關(guān)系尚未可知,也未見報道。研究目的:(1)探究MGP蛋白在UC發(fā)病過程中mRNA和蛋白表達改變及作用;(2)探討MGP蛋白的上游調(diào)控通路和下游通路,及其可能的功能。方法:分別采用實時定量PCR和免疫組化法檢測MGP mRNA和蛋白在UC患者病變結(jié)腸黏膜和健康對照者結(jié)腸黏膜組織中的表達。C57BL/6小鼠給予含不同濃度(分別為2%、2.5%、3%)葡聚糖硫酸鈉(DSS)以建立急性結(jié)腸炎模型(對照組n=5,不同DSS組n分別為5、9、6),造模后第9天處死小鼠后評價結(jié)腸大體和病理炎癥,免疫組化和westernblot法檢測病變結(jié)腸黏膜中差異表達的MGP蛋白的水平。生物信息學預測MGP可能受到早期生長反應基因-1(Egr1)及p38-MAPK-JNK通路調(diào)節(jié),westernblot法檢測小鼠結(jié)腸黏膜中Egr1、p38、磷酸化p38(p-p38)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)水平,以及黏膜屏障相關(guān)蛋白occludin、E-cadherin和腸三葉因子TFF3水平,分析其與MGP蛋白之間的相關(guān)性。雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)錄因子Egr1對MGP基因啟動子區(qū)活性的影響。脂多糖LPS刺激DLD-1細胞,建立體外炎性細胞模型,染色質(zhì)免疫沉淀法(CHIP)檢測Egr1與MGP基因啟動子區(qū)相結(jié)合。構(gòu)建MGP過表達慢病毒載體,感染結(jié)腸癌細胞Caco2和DLD1,嘌呤霉素篩選得到MGP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,westernblot檢測E-cadherin蛋白表達變化。結(jié)果:1.MGPmRNA在UC患者(n=50)腸黏膜中的表達較健康對照組(n=17)明顯升高,在重度UC患者中的表達水平高于輕中度UC患者(8.33±0.63 vs 3.87±0.35vs1.95±0.06,P0.01)。2.免疫組化結(jié)果顯示,MGP蛋白主要位于UC患者結(jié)腸黏膜上皮細胞和杯狀細胞的胞漿內(nèi),正常結(jié)腸黏膜內(nèi)未見明顯表達。2.DSS模型組小鼠體重下降明顯,病理炎癥評分顯著高于對照組(P0.01)。隨著DSS濃度增加,小鼠結(jié)腸炎癥加重,MGP的表達水平也呈逐漸升高趨勢,均明顯高于對照組小鼠。3.模型組小鼠結(jié)腸組織中Egr-1、p38、p-p38、JNK、p-JNK蛋白的表達均高于正常對照組小鼠(P0.01),與MGP的表達變化呈正相關(guān)性。E-cadherin、occludin、TFF3蛋白的表達低于對照組小鼠(P0.01),與MGP的表達變化呈負相關(guān)。4.轉(zhuǎn)錄因子Egr-1顯著增強MGP啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。5.脂多糖LPS刺激DLD-1細胞成功建立體外炎性細胞模型,CHIP結(jié)果顯示Egr1在MGP啟動子區(qū)的結(jié)合明顯增高。6.成功構(gòu)建MGP過表達慢病毒載體,感染Caco2和DLD1細胞后得到MGP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,MGPmRNA水平升高。E-cadherin蛋白表達較對照組細胞下降。結(jié)論:MGP蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎中表達升高,受到轉(zhuǎn)錄因子Egr-1及p38-MAPK-JNK通路的調(diào)控,可能通過影響腸道黏膜屏障參與腸道炎癥發(fā)病機制。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

動組明顯高于對照組、緩解組、輕度活動組和中度活動組，分別為７．?９３倍、５．４８??倍、４．?２７倍和２．１５倍（Ｐ均＜０．０１）。在對照組和緩解組、輕度活動組之間差異無??統(tǒng)計學意義（見圖２和表１１）。??ＭＧＰ??＜?＊＊??ｚ?１５－｜????＊＊??ｆ?：??Ｑ．????〇?？？??￥?１０－?：？??Ｉ?Ｔ?ｆ??＜Ｄ?？??Ｉ?５＂?總？??Ｉ?—令▼?▼▼??｜?〇?Ｉ??１?１?１?１—??／Ｖ?＃?／?／??ｉｆ?令??圖２?ＵＣ患者和對照者結(jié)腸黏膜組織中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表達情況??注：ｃｏｎｔｒｏｌ：對照組，ｎ＝１７；?ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：緩解組，ｎ?＝?７；?ｍｉｌｄ：輕度活動組ｎ??＝?１３；?ｍｏｄｅｒａｔｅ：中度活動組ｎ＝?１７；?ｓｅｖｅｒｅ：重度活動組ｎ?＝?１３。采用方差分析??（ＡＮ０ＶＡ），各組數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準誤（又土ＳＥＭ）表示。材／ＸＯ．?０１。??表１１?ＵＣ患者和對照者結(jié)腸黏膜組織中ＭＧＰ?ｍＲＮＡ的表達情況??分組?例數(shù)?ＭＧＰ?ｍＲＮＡ相與健康對照與緩解組與輕度活??（ｎ）?對表達?組比較?比較?動組比較??對照組?１７?１．０５±０．１２?—?—?—??緩解組?７?Ｌ?５２?±０．０３?Ｐ＝０．４０９??輕度活動組?１３?１．９５±０．０６?Ｐ＝Ｑ．?０６０?Ｐ＝０．４７９??中度活動組?ｎ?３．８７±０．３５?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１?Ｐ＜０．０１??重度活動組?１３?８．?３３±０．?６３?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１?Ｐ＜０．?０１??注：采用方差分析（ＡＮＯＶＡ）

免疫組化法檢測重度ＵＣ患者（ｎ＝９）和對照組（ｎ＝６）結(jié)腸黏膜中ＭＧＰ蛋白??的表達情況。ＭＧＰ蛋白表達于ＵＣ患者結(jié)腸黏膜上皮細胞和杯狀細胞的胞漿內(nèi)，在對??照者結(jié)腸黏膜中染色較弱或未見明顯陽性表達（圖３）。按照著色程度及陽性細胞??數(shù)量乘積得分進行評分后取平均值（詳見實驗方法６．免疫組織化學染色），ＵＣ患??者組ＭＧＰ蛋白相對表達量（２．?８９?±０．４２）顯著高于健康對照組（０．６７±０．２１），差??異有統(tǒng)計學意義（ｔ＝４．?０３，００１）（圖４和表１２）。??圖＿??？?人．’?？?．?＇■?：＇?？?ｔ?＊＊？．?＜?＃?－．ｖ－１?？?＊，?＊??＾?Ｄ??Ｂ．?－?Ｄ＇??圖３免疫組化檢測ＵＣ患者及對照組結(jié)腸黏膜中ＭＧＰ蛋白的表達情況??注：Ａ：對照組結(jié)腸黏膜病理Ｈ＆Ｅ染色（１００Ｘ）?；?Ｂ：對照組結(jié)腸黏膜ＭＧＰ蛋白免疫??組化染色未見陽性表達（１００Ｘ）?；?Ｃ

１．不同濃度ＤＳＳ模型小鼠模型的建立：??模型組小鼠第３—５天開始出現(xiàn)大便不成形、肉眼血便等結(jié)腸炎癥狀，同時伴有??體重下降、活動減少、毛發(fā)色澤變差，體重變化情況如圖４所示。隨著ＤＳＳ濃度（濃??度分別為２％、２．５％、３％）的增高，上述癥狀越明顯。癥狀最重多出現(xiàn)于第７?—８天，??表現(xiàn)為排便無糞質(zhì)僅有鮮血，或反復刺激小鼠排便后僅能排出少量粘液，此時體重??亦降至最低。２．５％ＤＳＳ組小鼠于第８天死亡１只，３％ＤＳＳ組于第７天、第８天各死亡２??只。??２５??
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本文編號：2878139