干擾素（IFN）和核苷類似物是臨床上治療慢性乙型肝炎（CHB）的常用藥物,具有抗病毒作用，能抑制乙肝病毒（HBV）DNA的復(fù)制。而核苷類似物普遍存在藥物抗性、療效不穩(wěn)定、長(zhǎng)期使用的安全性等問(wèn)題。因此，干擾素成為治療乙肝的首選藥物，然而常規(guī)干擾素制劑的血漿半衰期短，清除快，需大劑量長(zhǎng)期使用，停藥后易復(fù)發(fā)，更不能徹底消除HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）。綜上所述，開(kāi)辟一條全新有效的新途徑，清除致耐原，打破和逆轉(zhuǎn)機(jī)體持續(xù)性深度免疫耐受，意義重大。 隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，抗體也從血清抗體發(fā)展到基因工程抗體。本實(shí)驗(yàn)室成員前期已從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出人源抗HBsAg基因工程抗體，并利用PCR定點(diǎn)突變獲得二硫鍵穩(wěn)定的dsFv（disufide-stabilized Fv fragments）抗體，將人源抗表面抗原（HBsAg） dsFv抗體的干擾素輕鏈和重鏈基因通過(guò)自身切割肽F2A連接，置于同一開(kāi)放讀碼框（ORF），使抗體的輕鏈和重鏈在同一質(zhì)粒中串聯(lián)表達(dá)，最后連接到pEE14.1高效表達(dá)載體上，獲得表達(dá)抗體靶向干擾素的重組質(zhì)粒pEE14.1-dsFvα pr+。 本研究的目的在于在對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的新型靶向干擾素藥物進(jìn)行免疫功能驗(yàn)證，并選擇最優(yōu)的載體和藥物的組合。具體方法如下：首先，設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并通過(guò)酶切和PCR等方法構(gòu)建三種對(duì)照質(zhì)粒：只表達(dá)人普通α干擾素（IFN-α）基因的質(zhì)粒pEE14.1-IFN-α和pSCK-IFN-α；表達(dá)抗體靶向干擾素復(fù)合基因的質(zhì)粒pSCK-dsFvα pr+。并分別在真核哺乳細(xì)胞系293T中驗(yàn)證表達(dá)，再用ELISA，western等方法檢測(cè)表達(dá)水平。隨后，與實(shí)驗(yàn)室保存的另外3種質(zhì)粒： pEE14.1-dsFvα pr+， pVAX-IL-12-dsFvα pr+和pSCK-IL-12-dsFvα pr+分別免疫6到8周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠，間隔7天，每組3只，每只給藥30μg。在每次免疫前后均取血，定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠治療前后血清中病毒拷貝量，反映藥物的治療效果。最后，為了得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行了脈沖條件的優(yōu)化。將編碼熒光素酶基因的pGL-3-CMV質(zhì)粒利用肌肉注射配合電穿孔技術(shù)遞送至C57小鼠體內(nèi)，2次免疫結(jié)束后，檢測(cè)小鼠體內(nèi)的熒光素酶活性，通過(guò)熒光素酶活性的變化來(lái)比較不同脈沖時(shí)間和脈沖電壓在遞送質(zhì)粒DNA時(shí)所誘導(dǎo)的表達(dá)效率。 結(jié)果證實(shí)，構(gòu)建的質(zhì)粒均可成功表達(dá)，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后顯示，人源化抗體靶向干擾素較普通干擾素效果有明顯優(yōu)勢(shì)，可較大幅度降低病毒拷貝量，并且8個(gè)月后反彈很小。而經(jīng)過(guò)加工連入IL-12的抗體靶向干擾素效果更佳，有轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象。新的脈沖條件60v，50ms也較實(shí)驗(yàn)室前期用的180v，25ms表達(dá)效率高，且對(duì)注射局部肌肉組織的刺激和損傷較低。 綜上所述，人源抗HBsAg dsFv抗體靶向干擾素針對(duì)血循環(huán)中過(guò)量存在的致耐循環(huán)抗原（病毒顆粒和HBsAg亞病毒顆粒），使帶有抗體的免疫治療制劑與血液中的病毒顆粒和亞病毒顆粒靶向結(jié)合，有利于其被機(jī)體識(shí)別和免疫清除，從而大大解除了免疫耐受。有望成為一種新型的治療慢性肝炎的藥物，具有研發(fā)潛力。
【學(xué)位單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

嗜細(xì)胞的激活，直接誘導(dǎo)參與呼吸爆發(fā)的酶的合成，從而增強(qiáng)巨嗜細(xì)胞的殺傷能力；增強(qiáng)NK細(xì)胞識(shí)別結(jié)構(gòu)的表達(dá)，并上調(diào)NK細(xì)胞合成細(xì)胞毒性因子，促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷。圖1.1 干擾素的作用機(jī)制3 α-干擾素治療慢性乙型肝炎現(xiàn)狀與進(jìn)展抗病毒治療是慢性乙型肝炎（CHB）治療的核心題，但是單用干擾素治療慢性乙型肝炎(CHB)各地報(bào)道結(jié)果不一，療效在個(gè)體間有明顯差異，HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率約為30%~50%不等[14-16]，效果不十分理想，所以多種聯(lián)合治療，或?qū)Ω蓴_素的改造等新研究新方法不斷涌現(xiàn)。3.1 α-干擾素與其他藥物的聯(lián)合治療楊志勇，張冬平等人，對(duì)干擾素與膦甲酸鈉聯(lián)合應(yīng)用治療慢性乙型肝炎的療效進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：61名慢性乙肝患者在治療3個(gè)月后，聯(lián)合組與干擾素組對(duì)慢性乙肝患者血清HBeAg/抗-HBe轉(zhuǎn)換率分別為47.8%和28.9%(P>0.05)；對(duì)慢性乙肝患者血清HBV-DNA的陰轉(zhuǎn)率分別為69.5%和34.2%(P<0.01)，說(shuō)明干擾素和膦甲酸鈉聯(lián)用有協(xié)同作用，抗病毒療效要好于單用干擾素組[17]。鄭衛(wèi)東

圖2.1 IFN-α序列的擴(kuò)增圖M：DL 2 000maker；1-2：IFN-α 擴(kuò)增；3：陰性對(duì)照.I-IFN-α 的構(gòu)建FN-α片段與回收得到的pCI-GPI載體連接轉(zhuǎn)化后，提取行雙酶切鑒定，12g/L瓊脂糖電泳顯示，IFN-α成功連于干擾素分泌到胞外。圖2.2 pCI-GPI-IFN-α的酶切鑒定

圖2.2 pCI-GPI-IFN-α的酶切鑒定M：DL 5000maker；1-2：XhoI和EcoRI雙酶切.FN-α 的雙酶切鑒定的連有信號(hào)肽的IFN-α片段與載體pEE14.1連接后行雙酶切鑒定，12g/L瓊脂糖電泳顯示，3號(hào)和6號(hào)成功連入pEE14.1載體中。圖2.3 重組質(zhì)粒pEE14.1- IFN-α的雙酶切鑒定5000maker；1-7：SmaⅠ和EcoRⅠ雙酶切pEE14.1
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 許衛(wèi)平,周忠福,劉輝峰;CO_2激光后聯(lián)合干擾素-α控制尖銳濕疣復(fù)發(fā)32例[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);1998年03期

2 林茂樹(shù) ,王靜舒;復(fù)合干擾素-α治療慢性丙型肝炎[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2003年05期

3 馮艷;尖銳濕疣基底部注射干擾素治療10例報(bào)告[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年04期

4 單風(fēng)平;多相脂質(zhì)體人干擾素-α(HuIFN-α)包封率和滲漏的測(cè)定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1991年03期

5 盧桂蘭;乙肝患者應(yīng)用lamivudine和干擾素-α治療后的機(jī)體特異性T細(xì)胞反應(yīng)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2004年06期

6 張東華,張瑤珍,周慧君,劉術(shù)玲;干擾素-α治療惡性血液病24例[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);1998年03期

7 姚慧,曹春梅,金紅峰,單綺嫻,王琳琳,夏強(qiáng);應(yīng)用干擾素-α減弱大鼠血管內(nèi)皮依賴性的舒張作用[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年03期

8 陳燕清,張復(fù)春,冼建中,曹陽(yáng);干擾素-γ與干擾素-α治療肝纖維化的對(duì)比研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2003年04期

9 湯雄,蔡曉艷,徐貞秋;干擾素-α1b治療慢性乙型肝炎患者對(duì)血清肝纖維化標(biāo)記物的影響[J];實(shí)用肝臟病雜志;2003年03期

10 陳向軍,呂傳真;干擾素-α及其在重癥肌無(wú)力治療中的應(yīng)用(綜述)[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2000年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 孫明莉;應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選急性早幼粒細(xì)胞白血病維甲酸耐藥相關(guān)蛋白及其機(jī)制的探討[D];吉林大學(xué);2007年

2 李湘平;rAAV（重組腺相關(guān)病毒）介導(dǎo)干擾素-α基因治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 劉龍丁;IFN-α刺激相關(guān)細(xì)胞蛋白TIIMPSC和S24v2的功能分析[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2007年

4 宋宏彬;人源抗HBsAg抗體Fab段及dsFv基因的克隆和表達(dá)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);1999年

5 胡曉麗;自然殺傷細(xì)胞在慢性HCV感染及治療中的作用研究[D];吉林大學(xué);2012年

6 孫崇玲;LL-37在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中作用的研究[D];吉林大學(xué);2011年

7 辛桂杰;替諾福韋酯治療對(duì)慢性乙型肝炎療效及治療過(guò)程中宿主的免疫應(yīng)答研究[D];吉林大學(xué);2012年

8 郭敏;化濁解毒中藥血清及補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 高燕;人源抗HBsAg dsFv抗體靶向干擾素免疫功能驗(yàn)證[D];曲阜師范大學(xué);2012年

2 江樂(lè);人源抗HBsAg dsFv抗體靶向干擾素復(fù)合基因的克隆和表達(dá)[D];曲阜師范大學(xué);2010年

3 何強(qiáng);干擾素在山羊腺垂體相關(guān)激素分泌細(xì)胞中的分布[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

4 李蒙;柑橘潰瘍病菌單鏈二硫鍵穩(wěn)定重組抗體的設(shè)計(jì)構(gòu)建與表達(dá)[D];重慶大學(xué);2010年

5 陸泳旭;重組人干擾素-α2b的純化以及位點(diǎn)特異性PEG化研究[D];天津大學(xué);2010年

6 胡朝剛;干擾素-λ1對(duì)慢性HBV感染青少年患者外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞功能的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

7 李庭明;乙型肝炎病毒基因型與慢性乙型肝炎疾病重度以及干擾素療效的關(guān)系[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 張海梅;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖影響及機(jī)制探討[D];蘭州大學(xué);2007年

9 李海鷹;慢性粒細(xì)胞白血病患者嗜堿性粒細(xì)胞的新探索[D];蘭州大學(xué);2008年

10 呂愛(ài)云;慢乙肝干擾素近期療效與乙肝病毒基因型的關(guān)系研究[D];鄭州大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2878197