研究背景和目的丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,目前全球大約有1.85億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)。HCV感染后有74-86%的人發(fā)展為以肝纖維化為主要特征的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C virus,CHC),并有潛在發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌傾向。中國(guó)人群HCV感染率為3.2%,HCV感染在中國(guó)已經(jīng)成為乙型病毒性肝炎、結(jié)核、痢疾之后第四大傳染性疾病,尤其是35歲以上人群的HCV感染率持續(xù)增長(zhǎng),嚴(yán)重威脅著個(gè)人健康,給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前抗病毒治療是慢性丙型肝炎唯一有效的治療手段。自2011年直接作用抗病毒(direct acting antivirals,DAAs)藥物問世以來(lái),丙型肝炎的治療取得了突破性進(jìn)展。研究顯示,在西方發(fā)達(dá)國(guó)家,HCV NS5B核苷酸類似物sofosbuvir聯(lián)合利巴韋林或其他抗病毒藥物能夠治愈90%的HCV感染者。然而,由于價(jià)格昂貴,sofosbuvir等核苷酸類似物抗HCV藥物在我國(guó)至今仍未上市,基于干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療方案目前仍是中國(guó)和一些發(fā)展中國(guó)家公認(rèn)的治療慢性丙型肝炎的首選藥物。然而,按照傳統(tǒng)的聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療,仍會(huì)有將近50%的CHC患者不能獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response,SVR)。因此,篩選影響抗病毒治療療效的可能因素,完善抗病毒治療方案就顯得尤為重要。髓源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是由骨髓祖細(xì)胞和非成熟的髓樣細(xì)胞組成的異質(zhì)細(xì)胞群體,包括不成熟粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)等。其共同的特征是:骨髓起源、未成熟狀態(tài)和顯著的T細(xì)胞抑制功能。MDSCs在人體內(nèi)主要出現(xiàn)在外周血中。最近研究顯示髓源抑制細(xì)胞可以在腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病中大量積聚,并與疾病的不良預(yù)后有密切關(guān)系。當(dāng)發(fā)生微生物、寄生蟲或病毒感染、化療、自身免疫性疾病、應(yīng)激以后,均會(huì)促進(jìn)MDSCs增多。一項(xiàng)研究顯示HCV慢性感染可以誘導(dǎo)MDSCs的增長(zhǎng),該群細(xì)胞能夠有效抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生,導(dǎo)致HCV感染的慢性化。最近的報(bào)道顯示抗HCV病毒治療后,HCV慢性感染者血液中的HCV病毒載量與MDSCs具有相同的下降趨勢(shì),證明HCV病毒能夠促進(jìn)MDSCs的產(chǎn)生。大量研究已證實(shí)MDSCs數(shù)量的增長(zhǎng)與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān),但MDSCs與丙型肝炎患者抗病毒治療臨床預(yù)后的關(guān)系尚不十分清楚。本次研究重點(diǎn)了解髓源抑制細(xì)胞對(duì)CHC患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療臨床預(yù)后的影響及其潛在的機(jī)制。研究材料與方法 1研究材料2011年6月至2013年6月間,鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科和消化內(nèi)科收治的初治慢性丙型肝炎感染者共計(jì)206例(血清檢測(cè)HCV RNA和HCV抗體均陽(yáng)性,既往未接受過干擾素聯(lián)合利巴韋林治療),均接受標(biāo)準(zhǔn)療程聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療(PEG-IFN/RBV),停藥隨訪24周。所有患者排除以下情況:妊娠或哺乳期婦女,酒精性肝病、藥物性肝病、以及失代償期肝硬化者,合并其他肝炎病毒及艾滋病感染者,6個(gè)月內(nèi)接受過免疫抑制劑治療者,自身免疫性疾病患者,嚴(yán)重精神性疾病特別是抑郁癥患者,惡性腫瘤、甲狀腺疾病及吸毒或酗酒者,嚴(yán)重心腦血管疾病患者。共有180例病例最終完成整個(gè)治療和隨訪計(jì)劃、資料齊全,被納入統(tǒng)計(jì)分析。其中127例獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(SVR),53例未獲得持久病毒學(xué)應(yīng)答(Non-SVR)。20例健康人組成健康對(duì)照組。2研究方法本次研究采用巢式病例對(duì)照研究方法,從病例就診住院跟蹤隨訪到治療停藥滿24周,觀察SVR獲得情況。未獲得SVR的病例為病例組,獲得SVR的病例為對(duì)照組。隨訪觀察和收集了所有病例的人口學(xué)特征、臨床病理參數(shù)以及接受PEG-IFN/RBV治療療效的相關(guān)數(shù)據(jù);采集初治慢性丙型肝炎患者PEG-IFN/RBV抗病毒治療前后外周靜脈血10ml,密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞,流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+cell(M-MDSC)和HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+cell(G-MDSC)細(xì)胞含量及STAT3表達(dá)水平、CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖、功能、細(xì)胞周期和表型;采用流式細(xì)胞儀分選純化M-MDSC和G-MDSC,q RT-PCR檢測(cè)兩群細(xì)胞免疫抑制性基因表達(dá);MDSC與磁珠分選的CD4+T和CD8+T細(xì)胞共孵育,研究其對(duì)T細(xì)胞免疫抑制功能及表型變化的影響。使用EPIDATA3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)錄入數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(version 16.0;SPSS Inc,Chicago,IL,USA)和Graph Pad Prism software(version 5.0;San Diego,CA,USA)處理分析數(shù)據(jù)。定量資料符合正態(tài)分布時(shí)采用x±s表示,采用One-Way ANOVA test比較兩組間變量差異,多組間變量比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布時(shí)采用中位數(shù)和區(qū)間表示,使用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析兩組間變量差異,Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析多組間變量差異,兩兩組間比較采用Nemenyi method檢驗(yàn)。定性資料使用絕對(duì)數(shù)或百分比表示,根據(jù)需要采用Chi-square檢驗(yàn)或Fisher’s exact probability檢驗(yàn)變量的組間差異。采用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)分析變量間線性相關(guān)關(guān)系,采用單因素二分類Logistic回歸篩選影響HCV感染者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療預(yù)后的影響因素,將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量放入多因素二分類Logistic回歸分析,確定影響CHC患者抗病毒治療預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。采用Receiver operating characteristic curve(ROC)分析確定MDSCs預(yù)測(cè)SVR的最佳診斷界值(cut-off值)。采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。研究結(jié)果 第一部分影響慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后因素研究1 206例初治CHC患者納入研究隊(duì)列,其中180例完成標(biāo)準(zhǔn)抗病毒治療和隨訪,SVR應(yīng)答率為70.6%;2根據(jù)MDSCs表型,將其分為G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+)和M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+),Non-SVR組G-MDSCs顯著高于SVR組和健康對(duì)照(P0.05),三組M-MDSCs差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3 G-MDSCs與HCV RNA載量(r=0.41,P0.01)、ALT(r=0.51,P0.01)、AST(r=0.46,P0.01)、LSM(r=0.58,P0.01)呈正相關(guān)關(guān)系,與CD4+T細(xì)胞(r=-0.24,P0.01)和CD8+T細(xì)胞(r=-0.26,P0.01)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;M-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均無(wú)相關(guān)關(guān)系(P0.05)。4 ROC分析顯示G-MDSCs對(duì)SVR的預(yù)測(cè)價(jià)值最大,其最佳診斷界值為5.38%;5單因素和多因素Logistic回歸分析顯示HCV基因型(CI.95%:3.75-12.33;P0.01)、外周血G-MDSCs水平(CI.95%:1.62-5.47;P=0.01)和RVR(CI.95%:1.34-8.48;P=0.03)是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。第二部分慢性丙型肝炎患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞功能及表型的影響1 HCV核心蛋白可誘導(dǎo)PBMCs細(xì)胞表型向G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14-)轉(zhuǎn)化而不是M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14+),PEG-IFN/RBV通過降低HCV RNA減少G-MDSCs含量;2 G-MDSCs能通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸方式顯著抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌,Non-SVR患者G-MDSC抑制T細(xì)胞增殖的能力明顯強(qiáng)于SVR患者(P0.05),而兩組人群M-MDSC對(duì)T細(xì)胞增殖抑制能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3 G-MDSC可以促進(jìn)T細(xì)胞凋亡(P0.05),而M-MDSC則不會(huì)(P0.05),Non-SVR患者G-MDSC促進(jìn)T細(xì)胞凋亡的能力顯著高于SVR患者(P0.05);4 G-MDSC能夠顯著降低S期和G2期CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞而增加G0-G1期T細(xì)胞比例(P0.05);5 G-MDSC與中心記憶性CD4+T細(xì)胞(r=-0.46,P0.01)和中心記憶性CD8+T細(xì)胞(r=-0.28,P=0.02)呈負(fù)相關(guān)關(guān);M-MDSC與各記憶性T細(xì)胞亞群均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P0.05);6 CHC患者G-MDSCs與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.42,P0.05),并可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成(P0.05);M-MDSCs與Treg細(xì)胞無(wú)線性相關(guān)關(guān)系(r=0.23,P=0.08),不能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增長(zhǎng)(P0.05);7 CHC患者M(jìn)DSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞表型的改變,上調(diào)T細(xì)胞表達(dá)PD-1(P0.05)、CTLA-4和Tim-3(P0.05),下調(diào)OX40表達(dá)(P0.05)。第三部分慢性丙型肝炎患者M(jìn)DSCs抑制T細(xì)胞機(jī)制研究1 Non-SVR患者血清中Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6、IL-10表達(dá)高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2 Non-SVR患者G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6和IL-10基因表達(dá)高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3 Non-SVR患者G-MDSCs中STAT3及p-STAT3表達(dá)高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而M-MDSC中STAT3及p-STAT3表達(dá)在三組人群中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4 CHC患者使用S31-201阻斷MDSC的STAT3,STAT3、p-STAT3以及Arg-1水平均有顯著下降(P0.05);5相對(duì)于未阻斷STAT3的G-MDSC,阻斷STAT3后,G-MDSC對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌抑制功能顯著下降(P0.05);6 IL-10刺激能顯著增加G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達(dá)(P0.05);S31-201阻斷STAT3可以抑制IL-10活化STAT3引起的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達(dá)增加(P0.05);7 IL-10能夠促進(jìn)G-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05),不能促進(jìn)M-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05);S31-201能夠降低MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05);8 IL-10能夠促進(jìn)G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6 m RNA基因表達(dá)(P0.05),S31-201能夠阻斷IL-10的這一作用。結(jié)論 1 G-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、LSM呈正相關(guān)關(guān)系,與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素;2 HCV核心蛋白可促進(jìn)G-MDSCs而不是M-MDSCs增加,PEG-IFN/RBV通過抑制HCV復(fù)制顯著降低G-MDSCs;3 G-MDSCs能顯著抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖、IFN-γ分泌,促進(jìn)T細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)中心記憶性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分化、Treg細(xì)胞擴(kuò)增,上調(diào)T細(xì)胞表面PD-1、CTLA-4和Tim-3表達(dá);4 IL-10能夠通過激活MDSC的STAT3通路,增加Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達(dá),增強(qiáng)G-MDSCs對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的免疫抑制功能。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R512.63
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文對(duì)照表
引言
第一部分 影響慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后因素研究
    前言
    材料與方法
        1 材料
        2 方法
        3 研究?jī)?nèi)容
    統(tǒng)計(jì)分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 慢性丙型肝炎患者與健康對(duì)照一般情況及可比性分析
        2. CHC患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療療效
        3. CHC患者中獲得SVR者與未獲得SVR者臨床病理參數(shù)比較
        4. 外周血MDSCs對(duì)SVR的預(yù)測(cè)界值分析
        5. 外周血MDSCs細(xì)胞含量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系
        6. 影響CHC患者抗病毒治療持久病毒學(xué)應(yīng)答的因素分析
    討論
    小結(jié)
第二部分 慢性丙型肝炎患者 MDSCs 對(duì) T 細(xì)胞功能及表型的影響
    前言
    材料與方法
        1 研究材料
        2 研究方法
    研究?jī)?nèi)容
    統(tǒng)計(jì)分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 HCV核心蛋白誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生
        2. CHC患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制
        3. CHC患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞功能的抑制
        4. CHC患者M(jìn)DSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡
        5. CHC患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
        6. CHC患者M(jìn)DSCs對(duì)T細(xì)胞亞群的影響
        7 CHC患者M(jìn)DSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞表型的改變
    討論
    小結(jié)
第三部分 慢性丙型肝炎患者 MDSCs 抑制 T 細(xì)胞機(jī)制研究
    前言
    材料與方法
        1 研究材料
        2 研究方法
        3 研究?jī)?nèi)容
    統(tǒng)計(jì)分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 三組人群血清炎癥因子ELISA檢測(cè)
        2 三組人群PBMCs中的MDSCs抑制性基因檢測(cè)
        3 不同人群MDSCs細(xì)胞STAT3 表達(dá)比較
        4. 抑制劑阻斷STAT3 通路抑制MDSCs產(chǎn)生Arg-1
        5. STAT3 通路抑制劑對(duì)MDSCs抑制T細(xì)胞能力的影響
        6. IL-10 對(duì)STAT3 的激活作用
    討論
    小結(jié)
結(jié)論
研究創(chuàng)新與不足
    1 研究創(chuàng)新
    2 研究不足
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
附表
圖表目錄
攻讀博士期間發(fā)表的論文及參與的項(xiàng)目
致謝

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本文編號(hào)：2876873