研究背景 慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染引起的，已成為一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，全世界共有20億人曾感染過(guò)HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者。在慢性HBV感染者中，約15％～25％最終死于與HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），其中慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）、代償期和失代償期肝硬化患者的5年病死率分別為0%～2%、14%～20%和70%～86%。多年來(lái)，我國(guó)慢性乙肝的發(fā)病數(shù)和發(fā)病率一直高居前列，嚴(yán)重危害人民的健康，2006年衛(wèi)生部公布的全國(guó)乙型肝炎病毒感染流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1～59歲人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18%。 非酒精性脂肪肝�。∟onaleoholie Fatty Liver Disease，NAFLD）是除外過(guò)量飲酒和其他明確損肝因素所致的，以彌漫性大泡性脂肪肝變性為特征的獲得性代謝應(yīng)激性肝損傷，NAFLD是一種與胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括單純性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver，NAFL），脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis，NASH）及NASH相關(guān)肝硬化。流行病學(xué)調(diào)查表明，NAFLD已呈全球化流行趨勢(shì)，約20～30%甚至更高的的人患有NAFLD。我國(guó)NAFLD在過(guò)去的10年里增加了近一倍。NAFLD可以直接引起肝病發(fā)生發(fā)展，甚至引起急性肝功能衰竭（Acute Liver Failure，ALF）。臨床研究發(fā)現(xiàn)，許多CHB患者合并有NAFLD，這種現(xiàn)象越來(lái)越受到眾多的學(xué)者的重視，綜合一些大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，NAFLD在CHB人群中的發(fā)生率大約在11～15%之間。 研究證實(shí)，高達(dá)62％丙型肝炎患者合并有NAFLD，IR在HCV（Hepatitis C virus）感染者體內(nèi)廣泛存在。HCV基因型1型和4型可通過(guò)IR導(dǎo)致肝脂肪變性，基因型3型則能直接引起肝細(xì)胞的脂肪變性，這些代謝因素的影響，加速肝纖維化的形成以及肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。那么，HBV是否也會(huì)同HCV一樣導(dǎo)致IR？肝細(xì)胞脂肪變對(duì)肝內(nèi)HBV的復(fù)制、抗原的合成和表達(dá)有無(wú)影響？HBV在脂肪肝的發(fā)生過(guò)程中起協(xié)同還是拮抗作用？目前這些問(wèn)題已引起了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注，也是本研究的主要內(nèi)容。 本研究共分為以下四部分： 第一部分HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性模型的建立。 第二部分HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)HBVDNA和蛋白表達(dá)的影響研究。 第三部分HBV對(duì)脂肪變性HepG2.2.15細(xì)胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影響研究。 第四部分TGFβ1對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性的影響研究。 第一部分HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性模型的建立 實(shí)驗(yàn)一HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察 目的建立HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和傳代的條件，了解細(xì)胞增殖特性及HBV的復(fù)制和表達(dá)能力。 方法采用無(wú)菌培養(yǎng)方法，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加G418，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞的計(jì)數(shù)及活力鑒定，熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的HBV DNA，時(shí)間分辨熒光分析儀檢測(cè)HBsAg和HBeAg。 結(jié)果含10% FBS培養(yǎng)基可維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)，含70% FBS的凍存液可保證細(xì)胞復(fù)蘇成活率達(dá)90%，HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA、HBsAg及HBeAg量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而穩(wěn)步增長(zhǎng)。 結(jié)論HepG2/HepG2.2.15生長(zhǎng)快速，對(duì)培養(yǎng)基和凍存液血清濃度要求較高。定期向HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液中添加G418可保證HepG2.2.15內(nèi)HBV的穩(wěn)定復(fù)制和蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)二HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性模型的構(gòu)建 目的建立HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性的實(shí)驗(yàn)條件。 方法選擇油酸（OA）作為脂肪誘導(dǎo)劑，設(shè)定0.1～0.4mM濃度梯度對(duì)HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行脂變誘導(dǎo)。細(xì)胞分為對(duì)照組、二甲基亞砜（DMSO，油酸溶劑）組和不同濃度OA組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活性并制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，油紅O-蘇木素染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴情況并計(jì)算脂變率。 結(jié)果生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，OA濃度≤0.2mM時(shí)細(xì)胞增殖活力不受影響，OA濃度＞0.2mM后隨OA濃度增高細(xì)胞的增殖能力逐漸下降，0.2%DMSO不影響細(xì)胞的增殖。油紅O染色結(jié)果顯示，在0.2mM濃度OA作用下24h時(shí)細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)橘紅色小脂滴，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)脂滴逐漸增多增大，72h時(shí)形成明顯脂變。HepG2.2.15細(xì)胞在24h、48h時(shí)的平均脂變率均低于HepG2細(xì)胞（P=0.028，0.022），72h時(shí)無(wú)明顯差異（P=0.372）。 結(jié)論0.2mM濃度的OA作用72h可使HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞在不影響細(xì)胞增殖能力的情況下形成明顯的脂肪變性，HepG2.2.15細(xì)胞脂變程度在24h、48h時(shí)低于HepG2細(xì)胞，72h時(shí)無(wú)明顯差異。 實(shí)驗(yàn)三HepG2及HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)TG及ALT的影響 目的探討HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)TG及ALT的影響。 方法細(xì)胞分為HepG2細(xì)胞對(duì)照組（C1組），HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)照組（C2組），HepG2細(xì)胞脂變組（F1組），HepG2.2.15細(xì)胞脂變組（F2組），按照第一部分實(shí)驗(yàn)二方法對(duì)HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞用不同濃度OA進(jìn)行脂變誘導(dǎo)，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的TG及細(xì)胞上清液中的ALT。 結(jié)果 1、TG：配對(duì)t檢驗(yàn)，F(xiàn)1大于C1組，F(xiàn)2組大于C2組。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，F(xiàn)1組大于F2組，24h、48、72h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。 2、ALT：配對(duì)t檢驗(yàn)，F(xiàn)1組大于C1組，F(xiàn)2組大于C2組，48、72h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，F(xiàn)1組小于F2組，24h、48、72h均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。 結(jié)論：HBV可抑制脂變細(xì)胞TG的合成和增加脂變中細(xì)胞膜損傷。 第二部分HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)HBVDNA和蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)一、HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)HBV DNA的影響 目的探討肝細(xì)胞脂肪變性對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響。 方法細(xì)胞分為對(duì)照組（C2組）和脂變組（F2組），按照第一部分實(shí)驗(yàn)二建立的方法對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行脂變誘導(dǎo)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的HBVDNA。 結(jié)果對(duì)照組上清液中HBV DNA（對(duì)數(shù)值）隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)穩(wěn)定上升，呈一條直線，脂變組HBV DNA呈現(xiàn)曲折上升方式。配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：24h、48h、72h時(shí)F2組HBV DNA與C2組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.93，P=0.784；t=0.065，P=0.951；t=1.551，P=0.182）。 結(jié)論脂肪變性對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制能力無(wú)顯著影響，但會(huì)造成HBV DNA的復(fù)制的輕微波動(dòng)。 實(shí)驗(yàn)二、脂肪變性對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV蛋白表達(dá)的影響 目的探討肝細(xì)胞脂肪變性對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV標(biāo)記物表達(dá)的影響。 方法細(xì)胞分為對(duì)照組（C2組）和脂變組（F2組），按照第一部分實(shí)驗(yàn)二建立的方法對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行脂變誘導(dǎo)。采用時(shí)間分辨熒光分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清HBsAg、HBeAg。 結(jié)果 1、HBsAg的表達(dá)：配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)2與C2組24h相比，t=32.985，P＜0.001，48h相比t=5.843，P=0.002，72h相比t=10.517，P＜0.001，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示HepG2.2.15脂變組HBsAg的表達(dá)較對(duì)照組明顯下降。 2、HBeAg表達(dá)：配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)2與C2組24h相比t=0.283，P=0.789，48h相比t=0.523，P=0.623，72h相比t=-0.542，P=0.611，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示HepG2.2.15脂變組與對(duì)照組之間24h、48h、72h時(shí)HBeAg表達(dá)均無(wú)明顯變化。 結(jié)論HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)其胞內(nèi)HBV的HBsAg、HBeAg表達(dá)影響不同�？娠@著抑制HBsAg的合成表達(dá)，而對(duì)HBeAg無(wú)影響。提示HBsAg下降可能與脂變導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。 第三部分HBV對(duì)細(xì)胞脂肪變性 HepG2.2.15細(xì)胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影響研究 目的探討HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對(duì)SOCS-3、SREBP-1c通路的影響 方法細(xì)胞分為HepG2對(duì)照組（C1組）、HepG2.2.15對(duì)照組（C2組）、HepG2脂變組（F1組）、HepG2.2.15脂變組（F2組），按照第一部分實(shí)驗(yàn)二建立的方法對(duì)HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行脂變誘導(dǎo)，采用免疫組化法觀察SOCS-3及SREBP-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)SOCS-3及SREBP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)情況。 結(jié)果 1、免疫組化結(jié)果顯示，隨脂變作用時(shí)間的延長(zhǎng)HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)SOCS-3染色的逐漸變淡，SREBP-1c染色的逐漸加深； 2、SOCS-3 mRNA：C2組水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于C1組（P＜0.001），F(xiàn)1組較C1明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），F(xiàn)2組較C2組相比也出現(xiàn)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.173）。細(xì)胞*脂變有交互作用（F=25.547，P＜0.001）； 3、SREBP-1c mRNA：C2組表達(dá)明顯高于C1組（P=0.013），F(xiàn)1組較C1組，F(xiàn)2組較C2組均出現(xiàn)的表達(dá)上調(diào)。但F2組與C2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.002），F(xiàn)1組與C1組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。提示細(xì)胞*脂變有交互作用（F=5.04，P＜0.03）。 結(jié)論 1、SOCS-3：HBV基因的存在，可以抑制SOCS-3 mRNA的表達(dá)。兩組細(xì)胞脂變后SOCS-3蛋白和mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。HepG2細(xì)胞的下調(diào)程度高于HepG2.2.15細(xì)胞。SOCS-3 mRNA的影響隨細(xì)胞不同而不同； 2、SREBP-1c：兩組細(xì)胞脂變后SREBP-1c的表達(dá)均表現(xiàn)為上調(diào)，但HepG2.2.15細(xì)胞的上調(diào)程度高于HepG2細(xì)胞。提示脂變對(duì)HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞SREBP-1c mRNA的影響不同。HBV基因的存在可以促進(jìn)SREBP-1c mRNA的表達(dá)上調(diào)。 第四部分TGFβ1對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性的影響研究 目的 1、探討TGFβ1對(duì)脂變HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制及蛋白表達(dá)的影響； 2、探討HepG2/HepG2.2.15脂變過(guò)程中的TGFβ1與SOCS-3 mRNA、SREBP-1c mRNA的關(guān)系。 方法細(xì)胞分為HepG2/HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)照組（C1/C2組）和脂變組（F1/F2組），并在這兩組細(xì)胞體系內(nèi)加入5ng/ml TGFβ1干預(yù)，形成TGFβ1作用組（T1/T2）和脂變+TGFβ1組（TF1/TF2），采用時(shí)間分辨熒光分析儀檢測(cè)HBsAg、HBeAg，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HBV DNA、SOCS-3 mRNA及SREBP-1c mRNA。 結(jié)果 1、HBVDNA T2組與C2組比較P=0.056，TF2與F2組比較P=0.178，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脂變* TGFβ1無(wú)交互作用（F=10.026，P= 0.872）。 2、HBsAg T2組低于C2組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.961），TF2低于F2組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。脂變* TGFβ1有交互作用（F=15.49，P= 0.001）。 3、HBeAg T2組較C2組、TF2較F2組比較均出現(xiàn)降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.004，P=0.034）。脂變* TGFβ無(wú)交互作用（F=0.265，P=0.813）。 4、SOCS-3 mRNA T1組較C1組、TF1與F1組、T2組與C2組、TF2組F2組相比均發(fā)生下調(diào)（分別為P=0.050，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）,TF2與TF1相比，P＜0.001。脂變* TGFβ1有交互作用（F=1.872，P=0.184），細(xì)胞* TGFβ1無(wú)交互作用（F=12.628，P=0.001)。 5、SREBP-1c mRNA T1組較C1組、TF1與F1組、T2組與C2組、TF2組F2組相比均發(fā)生上調(diào)（P均≤0.001），TF2與TF1相比，P＜0.001。脂變* TGFβ1、細(xì)胞* TGFβ1無(wú)交互作用（F=7.655，P=0.009；F=9.70，P=0.003)。 結(jié)論 1、TGFβ1不影響HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制。 2、TGFβ1可抑制HBsAg的表達(dá)，抑制能力受脂變因素的影響，脂變組的強(qiáng)于非脂變組。 3、TGFβ1可抑制HBeAg的表達(dá)，抑制能力不受脂變因素的影響。 4、TGFβ1可抑制SOCS-3 mRNA的表達(dá)，這種抑制受脂變因素的影響，而與病毒因素?zé)o關(guān)。 5、TGFβ1可上調(diào)SREBP-1c mRNA的表達(dá)，這種上調(diào)與脂變因素及病毒因素?zé)o關(guān)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

解 完成 后 的標(biāo) 本 保 存在 - 2 0 ℃， 待 檢 。 解標(biāo) 本 15 00 0 r p m 離心 5m i n， 取上 清 4 μ l 做 P C R 反應(yīng) 。 R 反 應(yīng) 體 系 HB V P C R 反 應(yīng) 液 （ 含 引 物 、 探 針 、 Bu f f e r 、 dN T P s ） 2+ U N G 酶 1 μl ，加 入 標(biāo) 本 4μ l ， 同時(shí) 設(shè) 臨 界 對(duì)照 ， 陽(yáng) 性對(duì) 照 ， 陰 性對(duì) 照 R 反 應(yīng) 條件 保 溫 42 ℃ 5 m i n 后 ，9 4℃ 5 秒 ， 6 0℃ 4 0 秒 ，循 環(huán) 40 次保 溫 。 驗(yàn) 結(jié) 果 計(jì) 算 將 CT＜ 16 強(qiáng) 陽(yáng) 性 樣 品 ， 選 擇 3～ 1 5 個(gè) 循 環(huán) 的 平 均 熒 光 信分 析 CT，以剛 好 高于 陰 性 對(duì)照 品 的 擴(kuò)增 曲 線 最高 點(diǎn) ， 調(diào) 整閾 值 ， 熒光 檢 結(jié) 果e p G2 . 2 . 15 細(xì) 胞 HB V D NA 檢測(cè) 的實(shí) 時(shí)熒 光 曲 線 （圖 22 ， 圖 23 ）

圖.幾.口.任.廠

5HepG2細(xì)胞脂變48hSOCS-3×1000
【參考文獻(xiàn)】

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4 施軍平;范建高;;肝細(xì)胞脂肪變與乙型肝炎相關(guān)性研究進(jìn)展[J];國(guó)際消化病雜志;2008年02期

5 沈毅;羅春梅;;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1及其受體在非酒精性脂肪肝組織中表達(dá)的臨床意義[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年17期

6 石銘,許琳婧,韓博;病毒性乙型肝炎肝組織脂肪變性的相關(guān)因素分析[J];臨床肝膽病雜志;2005年02期

7 鄭黎黎;沈薇;;HBx與肝細(xì)胞脂肪變性關(guān)系及可能機(jī)制的細(xì)胞學(xué)研究[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年07期

8 趙文慧;韓德五;苗宇船;張曉艷;呂嫻;李炳蔚;趙元昌;;胰島素抵抗在非酒精性脂肪肝發(fā)病中的作用[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年06期

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10 李松濤;黃桂榮;周海波;劉寧;;牛源乳鐵蛋白體外抗HBsAg分泌的研究[J];衛(wèi)生研究;2008年02期

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