多種慢性肝病如病毒性肝炎、血吸蟲病、自身免疫性肝病等可導(dǎo)致肝纖維化形成。隨著病情的持續(xù)發(fā)展,會(huì)引起肝硬化、肝衰竭和死亡。近年來(lái),隨著對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA;lnc RNAs)研究的不斷深入,lnc RNAs廣泛參與多種生物學(xué)功能和病理過(guò)程,如在發(fā)育、增殖、凋亡、分化和癌變等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用研究還不是很多。在本研究中,我們旨在通過(guò)基因芯片篩選出在肝纖維化過(guò)程中異常表達(dá)并具有人鼠同源性的lnc RNAs;通過(guò)檢測(cè)肝纖維化、肝硬化患者血清標(biāo)本及肝組織標(biāo)本中l(wèi)nc RNAs的表達(dá)水平明確lnc RNAs與肝纖維化的關(guān)聯(lián),闡明lnc RNAs可以作為肝纖維化的早期臨床診斷標(biāo)志物;并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)揭示其在肝纖維化中發(fā)揮的作用及其機(jī)制,為肝纖維化的診斷治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。方法1.構(gòu)建肝纖維化小鼠模型,通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠的肝臟外觀、羥脯氨酸含量測(cè)定技術(shù)、HE染色和天狼猩紅染色、Western blot、q RT-PCR、免疫組化等技術(shù)驗(yàn)證肝纖維化小鼠模型構(gòu)建成功。2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出10個(gè)在肝纖維化中異常表達(dá)的lncRNAs,并通過(guò)KEGG Pathway分析、GO分析、同源性分析以及鄰近基因分析,篩選出一個(gè)在肝纖維化過(guò)程中過(guò)表達(dá)并具有人鼠同源性的lnc RNA即lnc-SCARNA10(ENSMUST00000158992)。3.在小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞以及小鼠原代HCs中通過(guò)c DNA末端快速擴(kuò)增(RACE)實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)小鼠lnc-Scarna10的全長(zhǎng)序列,并通過(guò)核漿分離提取RNA技術(shù)確定lnc-Scarna10在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中的定位。4.在小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞、小鼠原代HCs中檢測(cè)lnc-Scarna10的表達(dá);在正常人、肝纖維化患者、肝硬化患者的血清標(biāo)本和肝組織標(biāo)本中檢測(cè)lnc-SCARNA10的表達(dá),驗(yàn)證lnc-SCARNA10是否具有作為肝纖維化臨床診斷標(biāo)志物的潛能;在正常小鼠和肝纖維化模型小鼠的原代HCs中檢測(cè)lnc-Scarna10及纖維化相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因的表達(dá);在TGFβ處理的小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞和小鼠原代HCs中檢測(cè)lnc-Scarna10、纖維化相關(guān)基因、炎癥相關(guān)基因以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。5.構(gòu)建干擾lnc-Scarna10的慢病毒載體,病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞和小鼠原代HCs后,通過(guò)q RT-PCR、Western blot檢測(cè)lnc-Scarna10、纖維化相關(guān)基因、炎癥相關(guān)基因和凋亡基因的表達(dá)變化。6.構(gòu)建膽管結(jié)扎(BDL)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型,通過(guò)小鼠鼠尾靜脈注射干擾lnc-Scarna10的慢病毒載體證實(shí)lnc-Scarna10在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。7.在小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞、小鼠原代HCs中干擾或過(guò)表達(dá)lnc-Scarna10后,通過(guò)q RT-PCR、Western blot檢測(cè)芯片結(jié)果中提示的與肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)的TGF-β信號(hào)通路。結(jié)果1.本課題篩選出一個(gè)在肝纖維化過(guò)程中過(guò)表達(dá)并具有人鼠同源性的lnc-Scarna10;lnc-Scarna10在肝纖維化小鼠的原代HCs中的表達(dá)明顯升高;在TGFβ處理小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞和正常小鼠原代HCs后,lnc-Scarna10的表達(dá)也明顯升高。2.與正常人相比,在肝纖維化患者、肝硬化患者的血清和肝組織中l(wèi)nc-SCARNA10的表達(dá)明顯升高,且在肝硬化患者血清和肝組織標(biāo)本中的表達(dá)高于肝纖維化患者標(biāo)本。3.在小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞和正常小鼠原代HCs中,干擾lnc-Scarna10的表達(dá)可以抑制TGFβ引起的HCs凋亡以及纖維化相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的升高。4.在體內(nèi),干擾lnc-Scarna10的表達(dá)可以抑制膽管結(jié)扎(BDL)引起的小鼠肝纖維化的形成。提取各組小鼠原代HCs,結(jié)果證實(shí)lnc-Scarna10通過(guò)促進(jìn)HCs的凋亡以及纖維化相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。5.敲低lnc-Scarna10下調(diào)TGFβ信號(hào)通路中TGFβ、SMAD2/3、p-SMAD2/3、KLF6等相關(guān)組分和肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)論綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中過(guò)表達(dá)并具有人鼠同源性的lnc-Scarna10。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明lnc-Scarna10不僅可以促進(jìn)HCs的凋亡,而且可以促進(jìn)纖維化相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。機(jī)制上,lnc-Scarna10通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ信號(hào)通路促進(jìn)HCs凋亡,從而誘發(fā)肝纖維化的發(fā)生。進(jìn)一步的研究表明lnc-SCARNA10在肝纖維化患者和肝硬化患者的血清和肝組織中過(guò)表達(dá),且在肝硬化患者血清和肝組織標(biāo)本中的表達(dá)高于肝纖維化患者標(biāo)本,繼而揭示lnc-SCARNA10具有作為肝纖維化早期臨床診斷標(biāo)志物的可能,為肝纖維化的診斷治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

可見中央靜脈缺失、偏位或有 2 個(gè)以上，形成假小葉（圖1.1a）。天狼猩紅染色（Sirius Red staining）：因天狼猩紅和其襯染液都是強(qiáng)酸性染料，易與膠原分子中的堿性基團(tuán)結(jié)合且吸附牢靠。故可用于各種組織病變時(shí)對(duì)膠原纖維異�；蚶w維增生的研究中，膠原纖維被染成紅色。鏡下觀察可見對(duì)照組小鼠肝組織僅可見少量紅色纖維結(jié)締組織，而實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中可見大量呈現(xiàn)紅色的纖維結(jié)締組織沉積，沉積的纖維結(jié)締組織重新包饒壞死再生的肝細(xì)胞形成假小葉。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色（IHC staining）對(duì) Col1α1 和α-SMA 進(jìn)行檢測(cè)，DAB顯示為黃褐色即為陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)照組小鼠鏡下觀察 Col1α1 和α-SMA 呈陰性；實(shí)驗(yàn)組小鼠可見肝組織中 Col1α1 和α-SMA 呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，黃褐色在肝竇、中央靜脈周圍以及纖維間隔之間有明顯表達(dá)（圖 1.1a）。提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝組織總 RNA，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中的 Col1α1 和α-SMA 的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（圖 1.1b）。肝纖維化發(fā)生時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多，現(xiàn)已知細(xì)胞外基質(zhì)由膠原、非膠原糖蛋白以及蛋白多糖三種成分構(gòu)成，其中膠原含量最多。羥脯氨酸為膠原內(nèi)存在的一種非必需氨基酸，因此小鼠肝組織中羥脯氨酸含量的高低可以直接反映出肝纖維化的程度。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中羥脯氨酸的含量明顯高于對(duì)照組（圖 1.1c）。經(jīng)上述幾種方法，我們可以得出結(jié)論：經(jīng)過(guò)腹腔注射 CCl4后

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文達(dá)下調(diào)的 lncRNAs 有 447 個(gè)（圖 1.2a）。根據(jù) lncRNAs 的差異倍數(shù)，選取 10 個(gè)差異表達(dá)的 lncRNAs 并在 CCl4誘導(dǎo)的纖維化肝組織中進(jìn)行擴(kuò)大樣本的再次驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上篩選出顯著過(guò)表達(dá)的ENSMUST00000158992 ， 在 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 被 命 名 為 lnc-Scarna10 （ small Cajalbody-specific RNA 10, U85）做后續(xù)研究。同時(shí)通過(guò)同源序列比對(duì)找到在人基因組中同源轉(zhuǎn)錄本 lnc-SCARNA10。

23圖 1.3 Lnc-SCARNA10 的鑒定（a-b）cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)確定人（b）以及小鼠（a）lnc-Scarna10的全長(zhǎng)序列；（c）通過(guò)核漿分離技術(shù)提取小鼠正常原代 HCs 和小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12 細(xì)胞核 RNA 和細(xì)胞漿 RNA，qRT-PCR 檢測(cè) lnc-Scarna10 的細(xì)胞定位及表達(dá)。1.2.4 Lnc-Scarna10 表達(dá)譜的驗(yàn)證為了研究 lnc-Scarna10 在肝纖維化中的作用，我們?cè)跇?gòu)建的 BDL（膽管結(jié)扎）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中對(duì) lnc-Scarna10 在肝纖維化不同階段的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。小鼠分為對(duì)照開腹組、膽管結(jié)扎誘導(dǎo) 3 天、14 天、21 天四組。在每組處理時(shí)間終點(diǎn)分別麻醉處死小鼠，然后提取肝組織 RNA，qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn) Acta2 隨著肝纖維化程度的加深而表達(dá)水平逐漸升高，同時(shí) lnc-Scarna10 也表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)（圖 1.4a）。說(shuō)明 lnc-Scarna10 在肝纖維化中是高表達(dá)的，并在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中表達(dá)逐漸升高，與芯片結(jié)果一致。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭悅承;陸倫根;;單核細(xì)胞趨化蛋白-1及其受體在肝纖維化進(jìn)程中的作用[J];臨床肝膽病雜志;2019年12期

2 朱紅梅;王勤英;;非酒精性脂肪性肝病肝纖維化的診斷和治療進(jìn)展[J];臨床肝膽病雜志;2020年01期

3 王燕;馬燕;吳琦琦;莊小芳;王曉波;王曉忠;;非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展性肝纖維化危險(xiǎn)因素分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2019年01期

4 嚴(yán)何;;肝纖維化的機(jī)制及研究進(jìn)展[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2019年16期

5 楊鐵戈;梁爽;周波;;中藥治療肝纖維化研究進(jìn)展[J];中國(guó)民族民間醫(yī)藥;2019年08期

6 高洋;王娟;肖歡;朱麗容;徐娟;唐毅;;聲輻射力脈沖成像評(píng)價(jià)兒童肝纖維化的臨床應(yīng)用價(jià)值[J];臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志;2019年05期

7 王慧;許劍蘭;鄭成芳;陳靈芝;;miR-33a miR-133a對(duì)慢性乙肝感染患者肝纖維化評(píng)估作用[J];河北醫(yī)學(xué);2019年05期

8 徐列明;劉平;沈錫中;吳亞云;平鍵;;肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)[J];臨床肝膽病雜志;2019年07期

9 彭婕;李弼民;;肝纖維化的研究進(jìn)展[J];中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志;2019年24期

10 徐列明;劉平;沈錫中;吳亞云;平鍵;;肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2019年11期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 徐有翠;納米藥物用于治療肝纖維化的研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2019年

2 楊毅;多參數(shù)磁共振功能成像在體評(píng)估大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[D];上海交通大學(xué);2016年

3 肖永陶;膽道閉鎖肝纖維化及膽汁酸代謝的分子機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2016年

4 馮軼;新型苦參堿衍生物抑制肝星狀細(xì)胞活化及抗肝纖維化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

5 王艷歌;蟲源microRNA在日本血吸蟲病肝纖維化中的功能及其機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

6 卞爾保;Hotair在肝纖維化中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

7 李國(guó)娟;COX-2shRNA通過(guò)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞衰老改善肝纖維化的作用機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

8 張漢;ASPH促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用與機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

9 錢寶鑫;SND1延緩CCl_4誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝纖維化進(jìn)程但促進(jìn)肝癌的發(fā)生及發(fā)展[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

10 李雪萍;基于康復(fù)新液對(duì)肝纖維化模型大鼠的影響探究中醫(yī)肝絡(luò)病理論[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 方未英;Sorafenib類似物在小鼠肝纖維化進(jìn)程中的效用及機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2018年

2 高琪;SIRT1介導(dǎo)的TGFβ1信號(hào)通路在肝纖維化中的調(diào)控機(jī)制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 王曉翔;HDAC靶向抑制劑N2E的抗肝纖維化作用及其機(jī)制研究[D];廣東藥科大學(xué);2019年

4 王敬朝;lnc-Scarna10過(guò)表達(dá)誘發(fā)肝纖維化的機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

5 王世興;HBV-DNA聚合酶對(duì)肝纖維化形成的調(diào)控[D];天津醫(yī)科大學(xué);2019年

6 趙壯志;瞬時(shí)彈性成像技術(shù)（FibroTouch）診斷慢乙肝患者肝纖維化的影響因素分析[D];廣西中醫(yī)藥大學(xué);2019年

7 張祎婕;HIPPO信號(hào)通路在血吸蟲病肝纖維化中的調(diào)控機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2019年

8 曾茜茜;TRPC6介導(dǎo)的SOCE在肝纖維化中的作用及其機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2019年

9 郭凱旋;Brg1在肝纖維化中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2019年

10 張宇鑫;盤狀結(jié)構(gòu)域受體1胞外端對(duì)于肝臟纖維化預(yù)測(cè)作用的研究[D];華中科技大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2874212