肝纖維化過程中肝星狀細胞遷移及RhoA作用機制的研究 第一部分 膠原、生長因子(TGF β_1、PDGF-BB)對大鼠肝星狀細胞遷移及細胞骨架的影響 背景與目的：肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，在肝纖維化時，活化的HSC細胞增殖、收縮、分泌細胞因子及細胞外基質(zhì)成分合成增加，引起Disse間隙微環(huán)境的改變。從細胞生物學角度來看，HSC的活化及遷移至少包括細胞增殖變形、細胞內(nèi)纖維增生，細胞收縮性的獲得和通過信號傳導釋放各種細胞因子等改變。就大多數(shù)細胞而言這些環(huán)節(jié)均與疾病狀態(tài)下的細胞骨架重排有關。本實驗目的在于研究膠原、生長因子(TGF β_1、PDGF-BB)對大鼠肝星狀細胞遷移及細胞骨架的影響。 方法：分離培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細胞，用改良的Transwell Chamber觀察不同濃度膠原、生長因子(TGF β_1、PDGF-BB)直接及趨化刺激后細胞遷移改變，免疫熒光標記肌動蛋白細胞骨架，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察生長因子(TGF β_1、PDGF-BB)誘導后HSC細胞骨架的變化。 結果： 1．TGF β_1、PDGF-BB趨化及直接刺激均可引起HSC細胞遷移增加，與對照組相比，各濃度TGF β_1、PDGF-BB刺激后遷移細胞增加差異有顯著性意義(P＜0.01)；10μg／ml Ⅰ型膠原趨化及直接刺激后HSC遷移增加不明顯，當濃度達到50μg／ml時，其趨化刺激誘導遷移增加與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，當濃度達到100μg／ml時，其直接刺激誘導遷移增加與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)；不同濃度Ⅳ型膠原趨化及直接刺激對HSC遷移均無明顯影響。 2．激光共聚焦顯微鏡結果顯示，生長因子誘導前大鼠肝星狀細胞呈圓形，體積較小，TGF β_1、PDGF-BB刺激后細胞呈快速的形態(tài)改變：5ng／ml TGF β_1刺激5min后可見細胞伸展，絲狀偽足形成，15min后可見應力纖維，30min時應力纖維較前增加，并見粘著斑形成；10ng／ml PDGF-BB刺激5min后出現(xiàn)板狀偽足，15min時出現(xiàn)應力纖維及粘著斑，少量絲狀偽足，30min時應力纖維及絲狀偽足較前增加。 結論：Ⅰ型膠原、TGF β_1、PDGF-BB均可促進肝星狀細胞遷移，而Ⅳ型膠原對HSC遷移無影響；TGF β_1、PDGF-BB可誘導HSC細胞骨架的重建。Ⅰ型膠原與生長因子可通過此機制促進肝纖維化發(fā)展。 第二部分 TGFβ_1、PDGF-BB對大鼠肝星狀細胞內(nèi)Rho GTPase信號通路的影響 背景與目的：Rho家族小G蛋白是細胞骨架肌動蛋白的重要調(diào)節(jié)因子，目前眾多的研究集中在Rho家族成員中的Cdc42、Rac1和RhoA上。在細胞極化、細胞表型轉化及遷移過程中，Rho家族GTP酶是聯(lián)系細胞外信號與肌動蛋白細胞骨架系統(tǒng)的關鍵因子。我們已證實TGFβ_1、PDGF-BB可誘導HSC細胞骨架改變及促進細胞遷移，現(xiàn)進一步研究在此過程中Rho GTP酶的表達，初步推斷其在HSC細胞遷移中的信號傳導機制。 方法：用實時熒光定量PCR、Western blot及GST pull down方法檢測不同濃度TGFβ_1及PDGF-BB刺激后大鼠HSC內(nèi)RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA、總蛋白及活性蛋白表達的變化。 結果： 1．實時熒光定量PCR結果顯示：與對照組相比，TGFβ_1刺激后RhoA mRNA表達增加，并呈一定的濃度依賴性；而Rac1、Cdc42 mRNA表達無明顯變化；各濃度PDGF-BB刺激后大鼠肝星狀細胞RhoA、Cdc42、Rac1 mRNA表達無明顯差異。 2．Western blot檢測結果顯示，不同濃度TGFβ1、PDGF-BB對大鼠肝星狀細胞內(nèi)RhoA總蛋白表達均無明顯影響。 3．GST pull down結果顯示：與對照組相比，TGFβ_1刺激后活性的Cdc42、RhoA蛋白增加而活性Rac1蛋白的表達無明顯改變；不同濃度PDGF-BB刺激大鼠HSC后，活性Cdc42、Rac1、RhoA蛋白均增加，三種活性蛋白表達均在PDGF-BB濃度達到10ng/ml時達到最高值，再增加濃度蛋白表達不隨之升高。 結論：TGFβ_1調(diào)節(jié)大鼠HSC肌動蛋白骨架系統(tǒng)可能主要通過Cdc42、RhoA蛋白而非Rac1蛋白，而PDGF-BB則可能通過Cdc42、Rac1、RhoA蛋白的作用。提示Rho GTP酶可能為HSC活化及遷移的細胞生物學基礎。 第三部分 RhoA在大鼠HSC遷移及細胞骨架構建中的作用 目的：觀察RhoA突變對HSC遷移及細胞骨架改變的影響及PDGF-BB、TGFβ_1 的干預作用，為肝纖維化的基因治療尋求新的途徑。 方法：將含RhoA突變基因的質(zhì)粒轉染大鼠HSC構建野生型、活化突變型及顯性負突變型RhoA肝星狀細胞，Western blot檢測轉染后各組細胞RhoA表達。用改良的Transwell Chamber觀察Ⅰ型膠原、生長因子(TGFβ_1、PDGF-BB)直接及趨化刺激后轉染細胞遷移改變，免疫熒光標記肌動蛋白細胞骨架，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TGFβ_1、PDGF-BB誘導后細胞骨架的變化。 結果： 1．Western blot檢測顯示與未轉染的HSC相比，轉染活化突變型、野生型RhoA的HSC中RhoA蛋白表達明顯增加，轉染顯性負突變型RhoA的HSC中RhoA蛋白表達明顯減少。 2．野生型RhoA轉染細胞組生長因子刺激后應力纖維及偽足形成與未轉染組相似；PDGF-BB、TGFβ_1刺激后活化突變型RhoA轉染的HSC可見應力纖維隨時間延長而明顯增加、增粗，細胞周圍粘著斑形成增加，而絲狀偽足及板狀偽足形成無明顯變化；與此相反，顯性負突變型RhoA轉染HSC在刺激后未見應力纖維及粘著斑的出現(xiàn)。 3．與對照組相比，持續(xù)活化突變型及顯性負突變型RhoA轉染的HSC細胞遷移均減少。但Ⅰ型膠原、生長因子(TGFβ_1、PDGF-BB)直接及趨化刺激后細胞遷移仍有增加。 結論：RhoA參與了TGFβ1、PDGF-BB誘導后HSC肌動蛋白骨架系統(tǒng)的重排，為生長因子、膠原誘導大鼠HSC遷移的信號傳導途徑之一。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

復口.人學博!:學位論文第一部分圖1一1倒置顯微鏡及電子顯微鏡觀察的大鼠肝星狀細胞形態(tài)(A:原代od， x100;B:原代7d，x200:C:第二代10d，x200;D:掃描電鏡， x20000)3.。一SMA是HSC活化的標志。免疫組織化學染色顯示，培養(yǎng)10天的HSC。一SMA表達呈陽性，并被特異性抗體染成棕色細條索狀。HSC呈星形，胞體大，膜狀伸展(圖1一2)。90%以上活化的HSC表達陽性。圖1一2分離培養(yǎng)10d大鼠HSCa一SMA免疫組化染色(A:X200

一SMA是HSC活化的標志。免疫組織化學染色顯示，培養(yǎng)10天的HSC。一SMA表達呈陽性，并被特異性抗體染成棕色細條索狀。HSC呈星形，胞體大，膜狀伸展(圖1一2)。90%以上活化的HSC表達陽性。圖1一2分離培養(yǎng)10d大鼠HSCa一SMA免疫組化染色(A:X200，B:X400，SABC法)二、膠原、生長因子(TGFp，、PDGF一BB)對大鼠肝星狀細胞遷移的影響材料與方法(一)、材料與試劑(l)細胞:原代分離的大鼠HSC。(2)高糖DMEM培養(yǎng)基:(Gibeo，美國)。

上腔模擬正 常DiSse間隙微環(huán)境，加入大鼠HSC;下腔模擬肝臟炎癥時微環(huán)境，充滿DMEM。上下腔根據(jù)實驗需要加入不同趨化、刺激因子。系統(tǒng)需于37℃，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時使細胞透過膜遷移入下腔。(圖1一3)
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本文編號：2870731