背景和目的：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）編碼的HBx蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，它與HBV復(fù)制水平和HBV相關(guān)性原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)在永生化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中，有效的HBV復(fù)制依賴于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有關(guān)鍵作用。但在正常肝細(xì)胞中，HBx通過何種途徑調(diào)控HBV的復(fù)制、如何影響細(xì)胞增殖途徑以及其作用的確切功能區(qū)尚不清楚。本課題以正常原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HBx蛋白及其截短體對(duì)細(xì)胞周期和HBV復(fù)制水平的影響及其相互關(guān)系，并確認(rèn)HBx發(fā)揮上述作用的主要功能區(qū)，以揭示HBx蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期和HBV復(fù)制的分子機(jī)制。 方法： （1）運(yùn)用改良的原位兩步膠原酶灌流法對(duì)C57BL/6小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行分離純化，采用含多種添加物的無血清WME培養(yǎng)基對(duì)小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，過碘酸雪夫氏（Periodic acid-Schiff′s，PAS）染色、生化法鑒定肝細(xì)胞的功能和分化特性，免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)新鮮分離和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的細(xì)胞周期標(biāo)志物p16、p21、cyclinD1、cyclin E、cyclin A的表達(dá)水平。 （2）利用HBx及其截短體表達(dá)質(zhì)粒pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）/Western blot法檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)水平。Western blot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物表達(dá)水平。 （3）利用編碼HBV全基因組1.2倍體（payw1.2）的pGEM-HBV質(zhì)粒和HBx缺失突變的相同質(zhì)粒pGEM-HBV△X瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，將pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)分別與pGEM-HBV△X共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，IP/Western blot法檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼蛋白HBc的表達(dá)，Southern印跡雜交（Southern blot）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV復(fù)制水平。 （4）利用特異性沉默p53基因的miRNA干擾質(zhì)粒分別與pGEM-HBV和pGEM-HBV△X共轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞， IP/Western blot法鑒定p53沉默效率，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼的HBc蛋白的表達(dá)，Southern印跡雜交（Southern blot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBV復(fù)制水平。 結(jié)果： （1）原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝臟特異性功能和分化特性，并能維持與新鮮分離肝細(xì)胞相同的靜息細(xì)胞周期（G0期）狀態(tài)。 （2）在轉(zhuǎn)染后原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中IP/Western blot法能檢測(cè)到全長(zhǎng)HBx蛋白及其羧基端截短體HBx1-101、氨基端截短體HBx~(43-154)的表達(dá)，全長(zhǎng)HBx與HBx~(43-154)的表達(dá)水平相當(dāng)，而HBx1-101的表達(dá)水平明顯低于前兩者。全長(zhǎng)HBx與HBx~(43-154)能下調(diào)p16的表達(dá)水平，上調(diào)p21、cyclin D、cyclin E的表達(dá)水平，對(duì)cyclin A的表達(dá)水平無影響，HBx~(1-101)對(duì)上述細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)水平均無影響。在增加pSI-HA-X~(1-101)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以提高HBx~(1-101)蛋白表達(dá)水平之后，對(duì)細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)仍無影響。 （3）與pGEM-HBV△X組細(xì)胞相比， pGEM-HBV組細(xì)胞內(nèi)p16的表達(dá)下調(diào)，p21、cyclin D、cyclin E的表達(dá)上調(diào)，cyclin A的表達(dá)水平無明顯變化，且核心顆粒HBV DNA水平明顯高于pGEM-HBV△X組細(xì)胞。分別以全長(zhǎng)HBx和HBx43-154重建pGEM-HBV△X缺失的HBx蛋白表達(dá)之后，其各項(xiàng)細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)和核心顆粒HBV DNA均能夠恢復(fù)到與pGEM-HBV組細(xì)胞相似的水平，但即使增加pSI-HA-X~(1-101)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以使HBx~(1-101)蛋白表達(dá)水平與全長(zhǎng)HBx和HBx~(43-154)相當(dāng)，pGEM-HBV△X組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期標(biāo)志物的水平和核心顆粒HBV DNA水平仍然沒有明顯改變。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細(xì)胞中一致。 （4）轉(zhuǎn)染pGEM-HBV△X的細(xì)胞中，沉默p53基因的表達(dá)使p16表達(dá)下調(diào)，cyclin D1、cyclin E、cyclinA表達(dá)上調(diào)，對(duì)p21的表達(dá)水平無影響，并能使其核心顆粒HBV DNA水平上升，但不能達(dá)到與pGEM-HBV組細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃�。轉(zhuǎn)染pGEM-HBV的細(xì)胞中，沉默p53基因的表達(dá)對(duì)其細(xì)胞周期標(biāo)志物水平及核心顆粒HBV DNA水平均無明顯影響。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細(xì)胞一致。 結(jié)論：在保持靜息細(xì)胞周期狀態(tài)的原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中，HBx蛋白通過下調(diào)p16的表達(dá)，上調(diào)cyclin D、cyclin E的表達(dá)，使細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，且通過上調(diào)p21的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期，并由此促進(jìn)HBV的復(fù)制。HBx蛋白能通過上調(diào)p21的表達(dá)拮抗內(nèi)源性p53基因沉默導(dǎo)致的細(xì)胞周期向S期推進(jìn)，從而促進(jìn)HBV的復(fù)制。原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中HBx蛋白是維持HBV有效復(fù)制水平的關(guān)鍵因素，HBx的羧基端是HBx通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程促進(jìn)HBV復(fù)制的重要功能區(qū)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R735.7;R512.62
【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對(duì)照
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 維持靜息細(xì)胞周期的原代小鼠肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 HBx 蛋白及其截短體對(duì)原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞周期標(biāo)志物水平的影響
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
第三部分 HBV 復(fù)制背景下全長(zhǎng) HBx 蛋白及其截短體對(duì)細(xì)胞周期和 HBV 復(fù)制水平的影響及其相互關(guān)系
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
第四部分 沉默 p53 表達(dá)對(duì) HBx 蛋白促進(jìn) HBV 復(fù)制的影響
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
博士期間發(fā)表的論文

【參考文獻(xiàn)】

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1 嚴(yán)少南,鄧斌,龔作炯;肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞周期與端粒酶活性及HBV復(fù)制的關(guān)系[J];癌癥;2003年05期

本文編號(hào)：2868680