背景和目的：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）編碼的HBx蛋白是一種多功能調節(jié)蛋白，它與HBV復制水平和HBV相關性原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的發(fā)生和發(fā)展密切相關，但其具體調控機制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)在永生化和轉化細胞系中，有效的HBV復制依賴于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有關鍵作用。但在正常肝細胞中，HBx通過何種途徑調控HBV的復制、如何影響細胞增殖途徑以及其作用的確切功能區(qū)尚不清楚。本課題以正常原代培養(yǎng)小鼠肝細胞為研究對象，探討HBx蛋白及其截短體對細胞周期和HBV復制水平的影響及其相互關系，并確認HBx發(fā)揮上述作用的主要功能區(qū)，以揭示HBx蛋白參與調控細胞周期和HBV復制的分子機制。 方法： （1）運用改良的原位兩步膠原酶灌流法對C57BL/6小鼠肝細胞進行分離純化，采用含多種添加物的無血清WME培養(yǎng)基對小鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)，過碘酸雪夫氏（Periodic acid-Schiff′s，PAS）染色、生化法鑒定肝細胞的功能和分化特性，免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測新鮮分離和原代培養(yǎng)肝細胞的細胞周期標志物p16、p21、cyclinD1、cyclin E、cyclin A的表達水平。 （2）利用HBx及其截短體表達質粒pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)，瞬時轉染原代培養(yǎng)小鼠肝細胞，免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）/Western blot法檢測HBx蛋白表達水平。Western blot法檢測細胞上述周期標志物表達水平。 （3）利用編碼HBV全基因組1.2倍體（payw1.2）的pGEM-HBV質粒和HBx缺失突變的相同質粒pGEM-HBV△X瞬時轉染原代培養(yǎng)小鼠肝細胞，將pSI-HA-X、pSI-HA-X~(1-101)、pSI-HA-X~(43-154)分別與pGEM-HBV△X共轉染細胞，IP/Western blot法檢測HBx蛋白表達水平，Western blot法檢測細胞上述周期標志物及HBV編碼蛋白HBc的表達，Southern印跡雜交（Southern blot）及實時熒光定量PCR檢測HBV復制水平。 （4）利用特異性沉默p53基因的miRNA干擾質粒分別與pGEM-HBV和pGEM-HBV△X共轉染原代培養(yǎng)小鼠肝細胞， IP/Western blot法鑒定p53沉默效率，Western blot法檢測細胞上述周期標志物及HBV編碼的HBc蛋白的表達，Southern印跡雜交（Southern blot）和實時熒光定量PCR法檢測HBV復制水平。 結果： （1）原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝臟特異性功能和分化特性，并能維持與新鮮分離肝細胞相同的靜息細胞周期（G0期）狀態(tài)。 （2）在轉染后原代培養(yǎng)小鼠肝細胞中IP/Western blot法能檢測到全長HBx蛋白及其羧基端截短體HBx1-101、氨基端截短體HBx~(43-154)的表達，全長HBx與HBx~(43-154)的表達水平相當，而HBx1-101的表達水平明顯低于前兩者。全長HBx與HBx~(43-154)能下調p16的表達水平，上調p21、cyclin D、cyclin E的表達水平，對cyclin A的表達水平無影響，HBx~(1-101)對上述細胞周期標志物的表達水平均無影響。在增加pSI-HA-X~(1-101)質粒轉染量以提高HBx~(1-101)蛋白表達水平之后，對細胞周期標志物的表達仍無影響。 （3）與pGEM-HBV△X組細胞相比， pGEM-HBV組細胞內p16的表達下調，p21、cyclin D、cyclin E的表達上調，cyclin A的表達水平無明顯變化，且核心顆粒HBV DNA水平明顯高于pGEM-HBV△X組細胞。分別以全長HBx和HBx43-154重建pGEM-HBV△X缺失的HBx蛋白表達之后，其各項細胞周期標志物的表達和核心顆粒HBV DNA均能夠恢復到與pGEM-HBV組細胞相似的水平，但即使增加pSI-HA-X~(1-101)質粒轉染量以使HBx~(1-101)蛋白表達水平與全長HBx和HBx~(43-154)相當，pGEM-HBV△X組細胞內細胞周期標志物的水平和核心顆粒HBV DNA水平仍然沒有明顯改變。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細胞中一致。 （4）轉染pGEM-HBV△X的細胞中，沉默p53基因的表達使p16表達下調，cyclin D1、cyclin E、cyclinA表達上調，對p21的表達水平無影響，并能使其核心顆粒HBV DNA水平上升，但不能達到與pGEM-HBV組細胞相當?shù)乃�。轉染pGEM-HBV的細胞中，沉默p53基因的表達對其細胞周期標志物水平及核心顆粒HBV DNA水平均無明顯影響。HBV編碼的HBc蛋白水平在各組細胞一致。 結論：在保持靜息細胞周期狀態(tài)的原代培養(yǎng)小鼠肝細胞中，HBx蛋白通過下調p16的表達，上調cyclin D、cyclin E的表達，使細胞從G0期進入G1期，且通過上調p21的表達，使細胞停滯在G1期，并由此促進HBV的復制。HBx蛋白能通過上調p21的表達拮抗內源性p53基因沉默導致的細胞周期向S期推進，從而促進HBV的復制。原代培養(yǎng)小鼠肝細胞中HBx蛋白是維持HBV有效復制水平的關鍵因素，HBx的羧基端是HBx通過調控細胞周期進程促進HBV復制的重要功能區(qū)。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R735.7;R512.62
【文章目錄】：
英漢縮略語名詞對照
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 維持靜息細胞周期的原代小鼠肝細胞的分離培養(yǎng)及鑒定
    1 材料與方法
    2 結果
    3 討論
    參考文獻
第二部分 HBx 蛋白及其截短體對原代培養(yǎng)小鼠肝細胞周期標志物水平的影響
    1 材料與方法
    2 結果
    3 討論
    參考文獻
第三部分 HBV 復制背景下全長 HBx 蛋白及其截短體對細胞周期和 HBV 復制水平的影響及其相互關系
    1 材料與方法
    2 結果
    3 討論
    參考文獻
第四部分 沉默 p53 表達對 HBx 蛋白促進 HBV 復制的影響
    1 材料與方法
    2 結果
    3 討論
    參考文獻
全文總結
文獻綜述
    參考文獻
致謝
博士期間發(fā)表的論文

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 嚴少南,鄧斌,龔作炯;肝癌細胞系HepG2細胞周期與端粒酶活性及HBV復制的關系[J];癌癥;2003年05期

本文編號：2868680