研究背景與目的 門脈高壓癥常見于肝硬化,是以門靜脈系統(tǒng)血液動(dòng)力學(xué)異常變化為主要特征的綜合征,臨床常并發(fā)致死性上消化道大出血。肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞。目前研究認(rèn)為靜息型HSC激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨虷SC,是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此,對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、活化機(jī)制的研究頗受關(guān)注。但國(guó)內(nèi)外從生物力學(xué)角度研究HSC增殖活化機(jī)制的報(bào)道很少。 HSC位于肝板與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的Disse間隙內(nèi)。Disse間隙通過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞“窗口”與肝竇相聯(lián)系。在肝纖維化發(fā)展過程中,肝竇及Disse間隙壓力升高,HSC所受壓力增高。胞外壓力環(huán)境的變化有可能調(diào)節(jié)HSC的增殖活化及遷移功能。為此,本論文研究目的旨在揭示壓力在HSC生物活性中的調(diào)節(jié)作用,以深入闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制中壓力的重要性,也為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。 本研究在體外應(yīng)用壓力加載模型,模擬門脈高壓癥發(fā)展過程中不同大小的壓力,加載壓力作用HSC,觀察壓力對(duì)HSC的增殖、活化與遷移功能的影響,并探討其可能機(jī)制。研究共分三個(gè)部分:⑴大鼠肝星狀細(xì)胞的分離鑒定與培養(yǎng);⑵壓力對(duì)HSC增殖活化與遷移的影響;⑶壓力促HSC增殖活化與遷移的機(jī)制研究。方法 一、HSC的分離培養(yǎng)與鑒定 雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g),分離門靜脈并插管,依次灌注鏈酶蛋白酶—膠原酶,37℃原位消化,12%Nycodenz密度梯度離心獲得HSC,含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。 臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率。328nm紫外光下觀察HSC自發(fā)免疫熒光,免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞Desmin與α-SMA表達(dá),鑒定HSC純度。 二、壓力對(duì)HSC增殖活化與遷移功能的影響 ㈠壓力加載方法 采用可重復(fù)密閉的鋼制圓柱形容器,細(xì)胞培養(yǎng)板置于容器內(nèi),培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)30min;由入口輸入高壓氦氣,出口通過導(dǎo)管連接血壓計(jì)以確定加載壓力大小。壓力加載完畢后,關(guān)閉出入口,密閉容器,置于培養(yǎng)箱內(nèi)保持37℃。 ㈡HSC增殖活化的檢測(cè) 在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106 cells/ml密度種植靜息與活化HSC,無血清DMEM同步化24小時(shí),不同壓力(0mmHg,5mmHg,10mmHg,20mmHg,40mmHg,80mmHg)加載預(yù)設(shè)時(shí)間(1h,12h,24h),培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時(shí),CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖率,確定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及壓力加載最適時(shí)間;壓力加載后1小時(shí)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原與α-SMA的mRNA表達(dá);壓力加載1小時(shí),常壓下再培養(yǎng)24小時(shí)后,提取HSC總蛋白,Western-blot檢測(cè)TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA蛋白表達(dá)。 ㈣HSC細(xì)胞周期的檢測(cè) 在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106 cells/ml密度種植HSC,無血清培養(yǎng)基同步化24小時(shí),按不同壓力加載1小時(shí)后,在培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時(shí),消化收集細(xì)胞,PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSC細(xì)胞周期。 ㈤HSC細(xì)胞遷移的檢測(cè) ⒈劃痕實(shí)驗(yàn):在6cm培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106 cells/ml密度種植HSC,無血清培養(yǎng)基同步化24小時(shí),用Tip(1ml)尖端同一方向垂直劃痕,不同壓力加載1小時(shí)后,培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時(shí),顯微鏡下拍照,計(jì)算細(xì)胞遷移率=(作用前劃痕內(nèi)面垂直距離-作用后劃痕內(nèi)面垂直距離)/作用前劃痕內(nèi)面垂直距離×100%。⒉Transwell:在24孔板Transwell小室中按5×103 cells/well密度種植HSC,無血清DMEM同步化24小時(shí),不同壓力加載1小時(shí)后,培養(yǎng)箱內(nèi)常壓下再培養(yǎng)24小時(shí),含20%FBS的培養(yǎng)基趨化HSC 24小時(shí),結(jié)晶紫染色,計(jì)算遷移指數(shù)=底部細(xì)胞數(shù)目/(上部細(xì)胞+底部細(xì)胞)×100%。 三、壓力促HSC增殖活化與遷移的機(jī)制研究 選取10 mmHg作用1小時(shí)為干預(yù)條件,應(yīng)用特異性阻斷劑Herbimycin A(HA,900nM)抑制Src的磷酸化;PD98059(25μM)抑制Erk1/2的磷酸化;LY294002(25μM)抑制Akt的磷酸化;RT-PCR檢測(cè)β3-integrin,FAK,ILK,ETA,PDGF-B receptor,TGFβ1及TGFβ1 receptor的mRNA表達(dá)變化;并用Western-blot分別檢測(cè)信號(hào)通路蛋白Phospho- Src(Tyr418),Phospho-FAK(Tyr397),Phospho-FAK(Tyr576/577),Phospho-Akt (Ser473),Phospho-Erk1/2 (Thr185/ Tyr187),Phospho-p70S6k (Thr421/ Ser424),FAK,p70S6k及增殖活化相關(guān)蛋白TypeⅠcollagen、α-SMA和PCNA的表達(dá)水平;Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)包處理。多組間的比較用One-Way ANOVA方差分析:方差齊性用LSD方法比較;方差不齊用Dunnett’s方法比較。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 一、HSC的鑒定 臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定HSC存活率95%以上;自發(fā)熒光及Desmin、α-SMA免疫熒光檢測(cè)靜止與活化HSC細(xì)胞純度達(dá)95%以上,能滿足實(shí)驗(yàn)需要。 二、壓力對(duì)HSC增殖的影響 靜息(1天)與活化(14天)HSC用于壓力加載實(shí)驗(yàn)。10 mmHg作用1h明顯促進(jìn)靜息與活化HSC增殖(P0.01); 20mmHg作用1h促進(jìn)活化HSC增殖(P0.05);40mmHg作用1h和12h均抑制活化HSC增殖(P0.05); 80 mmHg作用12h明顯抑制靜息HSC增殖(P0.01);40 mmHg與80 mmHg作用24小時(shí)均明顯抑制靜息與活化HSC增殖(P0.01)。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇活化HSC,壓力作用時(shí)間選擇1h。 三、壓力對(duì)HSC細(xì)胞周期的影響 對(duì)活化HSC, 10 mmHg與20mmHg作用1小時(shí)均能增加S期細(xì)胞(P0.01),且10mmHg最為顯著;80 mmHg作用1小時(shí)減少S期細(xì)胞(P0.01);不同壓力對(duì)HSC的G0-G1及G2-M期并無明顯影響。 四、壓力對(duì)HSC活化的影響 10 mmHg(1h)明顯促進(jìn)a-SMA與TypeⅠcollagen的mRNA與蛋白水平的表達(dá)(P0.01); 40mmHg(1h)與80mmHg(1h)明顯抑制HSC的TypeⅠcollagen、α-SMA、PCNA蛋白表達(dá)(P0.01)。 五、壓力對(duì)HSC遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:10mmHg、20mmHg、40mmHg作用1h,HSC損傷區(qū)細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組增多,損傷區(qū)域間距縮短(P0.01),10mmHg最為顯著(P0.05);作用1小時(shí),5mmHg與80mmHg對(duì)HSC劃痕區(qū)域間距無明顯影響。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:10mmHg(1h)條件下,HSC遷移指數(shù)明顯增高(P0.01),且高于20mmHg(1h)(P0.01);80 mmHg(1h)條件下,膜下部遷移的HSC數(shù)量明顯減少(P0.05)。 六、壓力對(duì)HSC相關(guān)信號(hào)分子mRNA表達(dá)的影響 作用1小時(shí),10mmHg明顯促進(jìn)β3-integrin mRNA、FAK mRNA與TGFβ1 mRNA的表達(dá)(均P0.01);40mmHg與80mmHg明顯抑制β3-integrin mRNA的表達(dá)(均P0.01)。不同壓力(1h)對(duì)ETA mRNA、ILK mRNA、PDGF-B receptor mRNA、TGFβ1 receptor mRNA的表達(dá)無明顯影響。 七、壓力對(duì)HSC Src與FAK磷酸化時(shí)間的影響 10mmHg作用1h后,在0min,2min,5min,10min,20min,30min,60min,Phospho-Src(Tyr418)與Phospho-FAK(Tyr397)表達(dá)時(shí)間順序一致: 2min表達(dá)即明顯增強(qiáng)(P0.01),10min表達(dá)高峰(P0.01),并持續(xù)到20min(P0.01),30 min到60min表達(dá)減弱至初始水平。 結(jié)果提示后續(xù)磷酸化的蛋白均需在壓力作用后10min提取檢測(cè)較為合適。 八、壓力對(duì)HSC相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響作用1h,5mmHg對(duì)各蛋白的磷酸化無明顯影響;10mmHg與20mmHg能明顯促進(jìn)Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Erk1/2(Thr185/Tyr187), Akt(Ser473),p70S6k(Thr421/ Ser424)的磷酸化(均P0.01),40mmHg與80mmHg均抑制其磷酸化(均P0.01);而Phospho-FAK(Try576/577)在40mmHg時(shí)仍維持高表達(dá)(P0.01),80mmHg與0mmHg表達(dá)水平相當(dāng)。 作用24h,Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Akt(Ser473),p70S6k(Thr421/ Ser424),FAK(Try576/577)的磷酸化檢測(cè)不出,Phospho-Erk1/2(Thr185/ Tyr187)仍有表達(dá)。10mmHg對(duì)Erk1/2(Thr185/Tyr187)磷酸化無明顯影響;20mmHg,40mmHg,80mmHg均能促進(jìn)Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187)的表達(dá)(P0.05或P0.01),80mmHg最為明顯(P0.01)。 九、抑制劑對(duì)壓力所誘導(dǎo)的HSC相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 10mmHg作用1h明顯促進(jìn)Phospho-Sr(cTyr418),Phospho-FAK(Tyr397),Phospho-Akt(Ser473),Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187),Phospho-p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的表達(dá)(均P0.01);Herbimycin A抑制Src(Tyr418),FAK(Tyr397),Akt(Ser473),Erk1/2(Thr185/Tyr187),p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的磷酸化(均P0.01);LY294002抑制Akt(Ser473)與p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的磷酸化(均P0.01),對(duì)Phospho-Erk1/2(Thr185/Tyr187)蛋白的表達(dá)無明顯作用;PD98059抑制Erk1/2(Thr185/Tyr187)蛋白的磷酸化(P0.01),對(duì)Phospho-Akt(Ser473)與Phospho-p70S6k(Thr421/Ser424)蛋白的表達(dá)無明顯作用。 十、抑制劑對(duì)壓力所誘導(dǎo)的HSC增殖活化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 10mmHg作用1h明顯促進(jìn)PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表達(dá)(均P0.01);PD98059對(duì)10mmHg促PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表達(dá)均無明顯作用;LY294002與Herbimycin A明顯抑制10mmHg促PCNA,α-SMA,TypeⅠcollagen蛋白表達(dá)(均P0.01),且LY294002抑制TypeⅠcollagen蛋白表達(dá)作用明顯優(yōu)于Herbimycin A(P0.01)。 十一、抑制劑對(duì)壓力所誘導(dǎo)的HSC遷移影響 10mmHg壓力作用明顯促進(jìn)HSC的遷移; PD98059對(duì)10mmHg促HSC遷移無明顯抑制作用;LY294002與Herbimycin A顯著抑制10mmHg促HSC遷移作用(P0.01)。 結(jié)論 一、壓力能顯著促進(jìn)HSC的增殖、TypeⅠcollagen和α-SMA在mRNA與蛋白水平的表達(dá)、促進(jìn)活化HSC的遷移能力,提示病理性升高的肝竇內(nèi)壓力能促進(jìn)肝纖維化和門脈高壓的發(fā)展。 二、壓力促HSC增殖活化與遷移的作用與Integrin相關(guān)的FAK(Tyr397)自我磷酸化有關(guān),其上游信號(hào)由Src介導(dǎo),下游信號(hào)通過Akt-p70S6k途徑傳導(dǎo),與Erk1/2無關(guān)。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

HSC 存活率與性質(zhì)鑒定 A, 剛分離 HSC 光鏡形態(tài)（×100）；B，剛分離 HSC 臺(tái)盼藍(lán)拒染（×培養(yǎng) 24 小時(shí) HSC 自發(fā)熒光（×100）；D，培養(yǎng) 24 小時(shí) HSC 油紅 O 染色（×200）；E，培養(yǎng) 光鏡下形態(tài)（×100）；F，培養(yǎng) 14 天 HSC 光鏡下形態(tài)（×100）re 1 Identification of survival rate and characteristics of HSC A，Morphology of fresh Ht microscope (Original magnification ×100)； B，Trypan blue staining of fresh HSC (Onification ×400)；C，Autofluorescence of HSC after 24 hours in vitro(Original magnification ×Oil red“O” staining of HSC after 24 hours in vitro(Original magnification ×200)；E，Morphol at 7 days by light microscope (Original magnification ×100)；F，Morphology of HSC at 14 dt microscope (Original magnification ×100)靜息與活化 HSC 純度鑒定-

壓力對(duì)肝星狀細(xì)胞生物活性的靜息 HSC 胞漿內(nèi)結(jié)蛋白（Desmin）表達(dá)陽性，所有細(xì)胞核著藍(lán)色，細(xì)胞純度95%以上（圖 2）；靜息 HSC 胞漿內(nèi) α-SMA 表達(dá)陰性（圖 3）；活化 HSC 胞漿內(nèi) De表達(dá)陽性（圖 2），活化 HSC 胞漿內(nèi) α-SMA 表達(dá)陽性（圖 3），細(xì)胞純度約為 95%以

圖 2 靜息與活化 HSC Desmin 免疫細(xì)胞化學(xué) 2 天（×100）；14 天（×200）Figure 2 Immunocytochemistry for Desmin in quiescent and activated HSCDay 2(Original magnification ×100)；Day 14(Original magnification ×200)
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉紅巖;整合素激活FAK介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2000年01期

2 張宗棨;湯松偉;朱樑;吳國(guó)強(qiáng);姜宗來;施斌;;肝前型門靜脈高壓兔門脈系統(tǒng)血管應(yīng)力的研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2008年06期

本文編號(hào)：2865582