目的在Taurine、EGCG和Genistein聯(lián)合用藥作用大鼠肝星狀細胞及肝纖維化大鼠后,通過監(jiān)測細胞自噬的變化情況,分析自噬的信號調(diào)控機制,探討自噬與聯(lián)合用藥抗大鼠肝纖維化的關系。以闡明聯(lián)合用藥抑制細胞自噬從而抗大鼠肝纖維化的分子機制,為藥物的臨床應用奠定一定的藥理基礎。并期待發(fā)現(xiàn)新的肝纖維化發(fā)生發(fā)展參與因子或調(diào)控因子,為肝纖維化的治療提供新的思路。方法1.聯(lián)合用藥抑制大鼠肝星狀細胞自噬的細胞水平研究:(1)以HSC-T6為研究對象,分為對照組、聯(lián)合藥物組、自噬抑制劑Bafilomycin-A1組和聯(lián)合藥物+自噬抑制劑組。在聯(lián)合用藥作用大鼠肝星狀細胞后,通過CCK-8法測定細胞活力及存活率。(2)應用透射電鏡和吖啶橙熒光染色技術檢測細胞自噬體、自噬溶酶體的狀態(tài)(3)通過Western blot分析自噬標志蛋白LC3及Beclin-1的表達變化(4)通過mRFP-GFP-LC3慢病毒轉染HSC-T6標記追蹤LC3蛋白,以監(jiān)測細胞自噬動態(tài)變化。2.聯(lián)合用藥抑制大鼠肝星狀細胞自噬的動物水平研究:(1)以CCl_4誘導肝纖維化模型的SD大鼠進行實驗,分對照組、CCl_4模型組、聯(lián)合藥物組、自噬抑制劑3-MA組和聯(lián)合用藥+自噬抑制劑組。檢測各組大鼠血清中ALT和AST水平,采用HE染色及Masson染色分析各組大鼠肝纖維化程度。(2)通過透射電鏡觀測大鼠肝組織細胞的自噬體及自噬溶酶體的狀態(tài)。(3)采用Western blot和IHC技術分析大鼠肝組織自噬標志蛋白LC3及Beclin-1的表達。3.聯(lián)合用藥抑制大鼠肝星狀細胞自噬的信號調(diào)控機制研究:(1)以聯(lián)合用藥作用大鼠肝星狀細胞,通過qPCR和Western blot技術分析AMPK-mTOR信號通路上關鍵因子AMPK和mTOR等的mRNA、蛋白表達水平及磷酸化水平,并檢測細胞的增殖、肝纖維化相關因子TGF-β1、COL-Ⅰ的表達,以分析AMPK-mTOR信號通路在聯(lián)合用藥抗大鼠肝纖維化中的調(diào)控作用。(2)采用AMPK-mTOR通路的抑制劑Compound C干預大鼠肝星狀細胞,再應用聯(lián)合用藥作用細胞,觀察細胞的活力及存活率,檢測LC3、Beclin1表達水平以及AMPK通路關鍵因子AMPK和mTOR磷酸化水平,以分析AMPK-mTOR通路參與的聯(lián)合用藥抑制大鼠肝星狀細胞的自噬調(diào)控。結果1.聯(lián)合用藥抑制大鼠肝星狀細胞自噬:(1)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),活化HSCs中的自噬體數(shù)量明顯多于正常肝臟細胞,在聯(lián)合藥物作用之后,HSCs中自噬體數(shù)量顯著減少。(2)CCK-8檢測HSCs存活率表明,聯(lián)合藥物和自噬抑制劑Bafilomycin-A1均能明顯抑制HSCs增殖。(3)吖啶橙染色實驗中,對照組HSCs的紅色熒光區(qū)域格外明顯,細胞形態(tài)完好,聯(lián)合藥物+自噬抑制劑組細胞只有微弱的紅色熒光。(4)Western blot分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合藥物處理HSCs后,自噬標志性蛋白LC3-II和Beclin1表達量明顯降低。(5)以自噬抑制劑Bafilomycin-A1為對照,聯(lián)合藥物和Bafilomycin-A1作用細胞后,聯(lián)合藥物+Bafilomycin-A1組LC3-II的表達量明顯小于Bafilomycin-A1組,說明聯(lián)合藥物能進一步減少自噬體的合成。mRFP-GFP-LC3雙熒光結果顯示,與對照組相比,其他三組細胞出現(xiàn)明顯綠色熒光,其中聯(lián)合藥物+Bafilomycin-A1組綠色熒光最強,Merge圖像顯示聯(lián)合藥物組細胞熒光顏色偏綠,進一步證明聯(lián)合藥物能抑制HSCs細胞自噬體的生成。2.聯(lián)合用藥抑制肝纖維化大鼠的肝臟組織自噬:(1)CCl_4處理大鼠8周之后,血清中的AST和ALT水平明顯升高,聯(lián)合藥物處理之后,逐漸恢復到正常水平。(2)HE和Masson染色顯示,與正常組相比,模型組大鼠肝細胞濁腫變性,假小葉形成,結節(jié)周圍結締組織增生沉積出現(xiàn)交錯復雜的藍綠色網(wǎng)狀條紋,聯(lián)合藥物處理之后,匯管區(qū)纖維組織增生減少,纖維間隔變窄,炎脂肪空泡形成明顯減低。(3)收集大鼠肝臟組織,在透射電鏡下觀察,與正常大鼠肝臟組織相比,肝纖維化模型組大鼠肝臟中出現(xiàn)大量的自噬體,聯(lián)合藥物處理之后,自噬體數(shù)量明顯減少。(4)Western blot和IHC實驗結果顯示,與正常組相比,肝纖維化大鼠中LC3-II和Beclin1的表達量顯著增加,聯(lián)合藥物處理后LC3-II和Beclin1表達量明顯降低。3.聯(lián)合用藥對肝星狀細胞自噬信號通路的調(diào)控:(1)qPCR檢測結果顯示,與對照組相比,聯(lián)合藥物顯著抑制HSCs內(nèi)LC3、Beclin1、AMPK和mTOR基因mRNA水平的表達。其中,與Compound C組相比,聯(lián)合藥物+Compound C組中以上四個基因表達顯著降低。(2)Western blot結果顯示,聯(lián)合用藥干預HSCs之后p-AMPK表達降低,同時p-mTOR的表達升高。結論:1.聯(lián)合用藥抗大鼠肝纖維化作用與肝星狀細胞的自噬緊密相關�；罨母涡菭罴毎透卫w維化模型大鼠肝臟中出現(xiàn)大量自噬體,而聯(lián)合藥物能干預細胞的自噬,促使自噬體數(shù)量減少,細胞的增殖受抑制,同時聯(lián)合藥物降低自噬標志性蛋白LC3和Beclin1的表達。由此可見,聯(lián)合藥物抗大鼠肝纖維化的部分機理可能是通過調(diào)節(jié)細胞的自噬,影響細胞的增殖從而達到抗肝纖維化的目的。2.聯(lián)合藥物通過阻礙肝星狀細胞AMPK-mTOR信號通路抑制肝星狀細胞自噬。聯(lián)合藥物干預肝星狀細胞后,AMPK-mTOR信號通路中的關鍵因子LC3、Beclin1、AMPK和mTOR的基因、蛋白及磷酸化蛋白的表達部分顯著降低,肝纖維化因子TGF-β1和Col-1的表達也同時下降。我們推測聯(lián)合藥物抗肝纖維化的分子機制之一,可能是聯(lián)合藥物能抑制活化的HSCs中的AMPK-mTOR信號通路,致使細胞中的自噬進程受阻,而活化的HSCs沒有能量供給無法繼續(xù)增殖,從而達到抗大鼠肝纖維化作用。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

The viability of HSCs treated with TEG, Baf-A1 and TEG+Baf-A1. M***P<0.001vs Control, **P<0.01vs TEG+Baf-A1.圖 2 聯(lián)合藥物、自噬抑制劑對 HSCs 增殖的影響染色觀察聯(lián)合藥物對 HSCs 自噬溶酶體的影響結合雙鏈 DNA 時細胞核顯示綠色熒光，而在低應時發(fā)出紅色熒光。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，對照組中細胞形態(tài)完好；但是聯(lián)合藥物組和 Baf-A1 組只有淡出現(xiàn)皺縮和變圓等不正常形態(tài)，這說明聯(lián)合藥殖具有阻礙作用，同時聯(lián)合藥物會抑制肝星狀細見圖 3

gure 3. Effect of autophagy of TEG and Baf-A1 in HSCs by fluorescence microscopy after stainedacridine orange.圖 3 吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀察 HSCs 細胞自噬A: Control 組 B: TEG 組 C: Baf-A1 組 D: TEG+ Baf-A1 組 Western blot 分析聯(lián)合藥物對 HSCs 中 LC3-II 和 Beclin1 表達的影響聯(lián)合藥物作用 HSCs 細胞 24h 后，對照組、TEG 組、Baf-A1 組G+Baf-A1 組中的 LC3-II 的相對表達量分別為：1.5±0.13、1.1±0.08±0.29、2.31±0.23（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。由數(shù)據(jù)結果可對照組相比，TEG 組中 LC3-II 的表達量顯著降低，Baf-A1 組中 LC表達量卻顯著高于 TEG+ Baf-A1 組，而 TEG+ Baf-A1 組 LC3-II 的表于 TEG 組和 Baf-A1 組之間，可見 TEG 能抑制 HSCs 中自噬體合成

32igure 4. The protein levels of LC3-II in the HSCs treated with TEG, Baf-A1, and TEMean±SD. n = 3. *P<0.05vs Control, **P<0.01vsTEG.圖 4 TEG 對肝星狀細胞的 LC3-II 蛋白水平的影響A: TEG 組 B: Baf-A1 組 C: TEG+Baf-A1 組 D: Control 組
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本文編號：2865208