背景： 慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是我國(guó)發(fā)病率較高的傳染病之一。CHB的治療核心為抗病毒治療。包括拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替比夫定(LdT)等在內(nèi)的核苷(酸)類似物(Nucleos(t)ide analogs, NAs)因其口服給藥方便,價(jià)格相對(duì)低廉等原因目前應(yīng)用較為廣泛。但是NAs僅能抑制病毒復(fù)制,不能徹底清除肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (Covalently closed circular DNA, cccDNA),故需長(zhǎng)期用藥。隨著用藥人數(shù)的增加,治療時(shí)間的延長(zhǎng),NAs耐藥問(wèn)題逐漸凸現(xiàn)出來(lái),尤其是多藥耐藥(Multi-drug resistance, MDR)患者的出現(xiàn),臨床處理十分棘手�？寺y(cè)序是研究病毒準(zhǔn)種常用的方法,可以直觀顯示患者體內(nèi)病毒的耐藥基因變異模式,對(duì)研究多藥耐藥患者的基因變異特點(diǎn)、指導(dǎo)治療具有重要意義。 目的： 1.建立穩(wěn)定準(zhǔn)確的克隆測(cè)序方法,結(jié)合直接測(cè)序法分析克隆測(cè)序法在多藥耐藥檢測(cè)中的作用； 2.對(duì)多藥耐藥患者進(jìn)行克隆測(cè)序檢測(cè),以明確患者的耐藥基因變異模式,并對(duì)耐藥基因變異特點(diǎn)與臨床資料進(jìn)行初步分析,為多藥耐藥的后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床治療提供線索和依據(jù)。 方法： 1.篩集2008年6月-2009年9月于北京地壇醫(yī)院就診的CHB患者中發(fā)生多藥耐藥的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者正在接受單藥或聯(lián)合抗病毒治療,并且出現(xiàn)治療失敗,經(jīng)直接測(cè)序法檢測(cè)診斷為核苷(酸)類似物(包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋或替比夫定)多藥耐藥。 2.用直接測(cè)序法確定患者屬于多藥耐藥患者后,運(yùn)用克隆測(cè)序的方法,從每位患者隨機(jī)挑取約40個(gè)克隆,對(duì)菌液聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)及酶切鑒定陽(yáng)性的單克隆進(jìn)行測(cè)序,分析患者的基因型和耐藥基因變異模式,并與患者既往的治療策略及有無(wú)生化學(xué)突破、病毒學(xué)突破和病毒載量相結(jié)合進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.8例患者及1例隨訪患者共9份標(biāo)本經(jīng)巢式PCR(nt-PCR)直接測(cè)序,證實(shí)全部為拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋或替比夫定多藥耐藥。 2.分析經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定雙陽(yáng)性并測(cè)序成功的237個(gè)單克隆,7例患者的多藥耐藥變異位點(diǎn)共存于同一病毒序列,1例患者的LAM耐藥變異位點(diǎn)和ADV耐藥變異位點(diǎn)分別存在于不同的病毒序列,且該患者的ADV耐藥變異為原發(fā)性耐藥。 3.9份標(biāo)本及237個(gè)單克隆測(cè)序全部為基因C型。 4.發(fā)生LAM+ADV耐藥的克隆所占比例最大,其次為ADV單藥耐藥及LAM+LdT耐藥,患者的耐藥基因變異模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T為主。 5.單藥換藥治療易發(fā)生多藥耐藥,在LAM換用ETV的患者中LAM、ETV耐藥幾率較高。 6.6例患者發(fā)生病毒學(xué)突破,病毒載量較高的患者對(duì)ADV+LAM耐藥的基因突變主要為M204V+A181V+L180M,對(duì)LAM+ADV+LdT+ETV耐藥的變異主要是M204I+T184I+ A181S+L80I; 2例患者在發(fā)生LAM+ADV耐藥后換用LdT治療的過(guò)程中發(fā)生病毒學(xué)突破,但檢測(cè)結(jié)果均為M204V+A181V+L180M聯(lián)合變異。 7.發(fā)生病毒學(xué)突破后病毒載量較高的患者及治療過(guò)程中HBV DNA持續(xù)高于檢測(cè)下限的患者中存在低比率的ETV、LAM或LdT原發(fā)性耐藥位點(diǎn)。 8.發(fā)現(xiàn)了諸多新的耐藥相關(guān)變異位點(diǎn),對(duì)其臨床意義尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)論： 1.多藥耐藥的變異位點(diǎn)多共存于同一病毒序列,也可分別存在于不同病毒序列,后者似與原發(fā)耐藥有關(guān)。 2.發(fā)生LAM+ADV耐藥患者的耐藥基因變異模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T為主。 3.單藥換藥治療更容易發(fā)生多藥耐藥。 4.發(fā)生病毒學(xué)突破且病毒載量較高的患者,其耐藥基因變異模式復(fù)雜。 5.患者體內(nèi)可能存在低比率的原發(fā)性耐藥變異株。 6.發(fā)現(xiàn)了諸多新的耐藥變異位點(diǎn),需體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

4.克隆測(cè)序菌液PCR、酶切鑒定9份標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物與pGEM一T-easy載體連接轉(zhuǎn)化后，各挑取40個(gè)單克隆搖菌，取菌液PCR鑒定陽(yáng)性(圖4)及酶切鑒定陽(yáng)性(圖5)的單克隆送測(cè)序。圖4菌液PCR鑒定n。指陰性對(duì)照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13號(hào)PCR陰性圖5質(zhì)粒酶切鑒定ZL指質(zhì)粒對(duì)照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的條帶!0

4.克隆測(cè)序菌液PCR、酶切鑒定9份標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物與pGEM一T-easy載體連接轉(zhuǎn)化后，各挑取40個(gè)單克隆搖菌，取菌液PCR鑒定陽(yáng)性(圖4)及酶切鑒定陽(yáng)性(圖5)的單克隆送測(cè)序。圖4菌液PCR鑒定n。指陰性對(duì)照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13號(hào)PCR陰性圖5質(zhì)粒酶切鑒定ZL指質(zhì)粒對(duì)照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的條帶!0

8例患者共獲得237個(gè)PCR、酶切鑒定雙陽(yáng)性并測(cè)序成功的單克隆。運(yùn)用、乞 cforNTI10.0軟件逐一分析每位患者各克隆的變異情況， vectorNTI10.0軟件的Allg”x程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，分析每位患者眾多克隆中各變異位點(diǎn)的總體情況如圖6，黃色區(qū)域代表各個(gè)克隆株中一致的基因序列，藍(lán)白區(qū)域代表存在異質(zhì)性的基因序列，其中藍(lán)色代表占主要比例的堿基。經(jīng)分析7例患者其多藥耐藥基因變異位點(diǎn)存在于同一病毒序列，只有1例患者LAM耐藥相關(guān)變異和ADV耐藥相關(guān)變異分別存在于不同的病毒序列。另外還發(fā)現(xiàn)了許多直接測(cè)序法未檢測(cè)到的變異位點(diǎn)，例如615、735及893號(hào)患者發(fā)現(xiàn)恩替卡韋相關(guān)M25oV變異，893、1059及1084號(hào)患者發(fā)現(xiàn)阿德福韋酷相關(guān)N2365變異等。破破 }}}沁‘物創(chuàng)璐腸的，的，10，劫”O(jiān)
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本文編號(hào)：2864958