背景： 慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是我國發(fā)病率較高的傳染病之一。CHB的治療核心為抗病毒治療。包括拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替比夫定(LdT)等在內(nèi)的核苷(酸)類似物(Nucleos(t)ide analogs, NAs)因其口服給藥方便,價格相對低廉等原因目前應(yīng)用較為廣泛。但是NAs僅能抑制病毒復(fù)制,不能徹底清除肝細(xì)胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA (Covalently closed circular DNA, cccDNA),故需長期用藥。隨著用藥人數(shù)的增加,治療時間的延長,NAs耐藥問題逐漸凸現(xiàn)出來,尤其是多藥耐藥(Multi-drug resistance, MDR)患者的出現(xiàn),臨床處理十分棘手�？寺y序是研究病毒準(zhǔn)種常用的方法,可以直觀顯示患者體內(nèi)病毒的耐藥基因變異模式,對研究多藥耐藥患者的基因變異特點、指導(dǎo)治療具有重要意義。 目的： 1.建立穩(wěn)定準(zhǔn)確的克隆測序方法,結(jié)合直接測序法分析克隆測序法在多藥耐藥檢測中的作用； 2.對多藥耐藥患者進行克隆測序檢測,以明確患者的耐藥基因變異模式,并對耐藥基因變異特點與臨床資料進行初步分析,為多藥耐藥的后續(xù)的實驗室研究和臨床治療提供線索和依據(jù)。 方法： 1.篩集2008年6月-2009年9月于北京地壇醫(yī)院就診的CHB患者中發(fā)生多藥耐藥的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者正在接受單藥或聯(lián)合抗病毒治療,并且出現(xiàn)治療失敗,經(jīng)直接測序法檢測診斷為核苷(酸)類似物(包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋或替比夫定)多藥耐藥。 2.用直接測序法確定患者屬于多藥耐藥患者后,運用克隆測序的方法,從每位患者隨機挑取約40個克隆,對菌液聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)及酶切鑒定陽性的單克隆進行測序,分析患者的基因型和耐藥基因變異模式,并與患者既往的治療策略及有無生化學(xué)突破、病毒學(xué)突破和病毒載量相結(jié)合進行分析。 結(jié)果： 1.8例患者及1例隨訪患者共9份標(biāo)本經(jīng)巢式PCR(nt-PCR)直接測序,證實全部為拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋或替比夫定多藥耐藥。 2.分析經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定雙陽性并測序成功的237個單克隆,7例患者的多藥耐藥變異位點共存于同一病毒序列,1例患者的LAM耐藥變異位點和ADV耐藥變異位點分別存在于不同的病毒序列,且該患者的ADV耐藥變異為原發(fā)性耐藥。 3.9份標(biāo)本及237個單克隆測序全部為基因C型。 4.發(fā)生LAM+ADV耐藥的克隆所占比例最大,其次為ADV單藥耐藥及LAM+LdT耐藥,患者的耐藥基因變異模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T為主。 5.單藥換藥治療易發(fā)生多藥耐藥,在LAM換用ETV的患者中LAM、ETV耐藥幾率較高。 6.6例患者發(fā)生病毒學(xué)突破,病毒載量較高的患者對ADV+LAM耐藥的基因突變主要為M204V+A181V+L180M,對LAM+ADV+LdT+ETV耐藥的變異主要是M204I+T184I+ A181S+L80I; 2例患者在發(fā)生LAM+ADV耐藥后換用LdT治療的過程中發(fā)生病毒學(xué)突破,但檢測結(jié)果均為M204V+A181V+L180M聯(lián)合變異。 7.發(fā)生病毒學(xué)突破后病毒載量較高的患者及治療過程中HBV DNA持續(xù)高于檢測下限的患者中存在低比率的ETV、LAM或LdT原發(fā)性耐藥位點。 8.發(fā)現(xiàn)了諸多新的耐藥相關(guān)變異位點,對其臨床意義尚需進一步驗證。 結(jié)論： 1.多藥耐藥的變異位點多共存于同一病毒序列,也可分別存在于不同病毒序列,后者似與原發(fā)耐藥有關(guān)。 2.發(fā)生LAM+ADV耐藥患者的耐藥基因變異模式以M204V+A181V+L180M及M204I+A181T為主。 3.單藥換藥治療更容易發(fā)生多藥耐藥。 4.發(fā)生病毒學(xué)突破且病毒載量較高的患者,其耐藥基因變異模式復(fù)雜。 5.患者體內(nèi)可能存在低比率的原發(fā)性耐藥變異株。 6.發(fā)現(xiàn)了諸多新的耐藥變異位點,需體外實驗進一步證實。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

4.克隆測序菌液PCR、酶切鑒定9份標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物與pGEM一T-easy載體連接轉(zhuǎn)化后，各挑取40個單克隆搖菌，取菌液PCR鑒定陽性(圖4)及酶切鑒定陽性(圖5)的單克隆送測序。圖4菌液PCR鑒定n。指陰性對照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13號PCR陰性圖5質(zhì)粒酶切鑒定ZL指質(zhì)粒對照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的條帶!0

4.克隆測序菌液PCR、酶切鑒定9份標(biāo)本的第二輪PCR產(chǎn)物與pGEM一T-easy載體連接轉(zhuǎn)化后，各挑取40個單克隆搖菌，取菌液PCR鑒定陽性(圖4)及酶切鑒定陽性(圖5)的單克隆送測序。圖4菌液PCR鑒定n。指陰性對照，mZk指 DNAMarker2000，其中6，9，13號PCR陰性圖5質(zhì)粒酶切鑒定ZL指質(zhì)粒對照，MZK指 oNAMarker2000，s00bp左右均有目的條帶!0

8例患者共獲得237個PCR、酶切鑒定雙陽性并測序成功的單克隆。運用、乞 cforNTI10.0軟件逐一分析每位患者各克隆的變異情況， vectorNTI10.0軟件的Allg”x程序?qū)y序結(jié)果進行比對，分析每位患者眾多克隆中各變異位點的總體情況如圖6，黃色區(qū)域代表各個克隆株中一致的基因序列，藍白區(qū)域代表存在異質(zhì)性的基因序列，其中藍色代表占主要比例的堿基。經(jīng)分析7例患者其多藥耐藥基因變異位點存在于同一病毒序列，只有1例患者LAM耐藥相關(guān)變異和ADV耐藥相關(guān)變異分別存在于不同的病毒序列。另外還發(fā)現(xiàn)了許多直接測序法未檢測到的變異位點，例如615、735及893號患者發(fā)現(xiàn)恩替卡韋相關(guān)M25oV變異，893、1059及1084號患者發(fā)現(xiàn)阿德福韋酷相關(guān)N2365變異等。破破 }}}沁‘物創(chuàng)璐腸的，的，10，劫”O(jiān)
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬鳴崗;肝癌高發(fā)區(qū)乙型肝炎血清學(xué)調(diào)查[J];北京醫(yī)學(xué);1981年03期

2 劉聲隆;周維其;顏心裕;李先惠;張育華;林體淑;劉文芳;劉繼明;余蓉;;雙重免疫阻斷乙型肝炎病毒母嬰傳播效果研究[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1986年01期

3 邵惠訓(xùn);乙型肝炎病毒DNA的結(jié)構(gòu)[J];中國生物工程雜志;1987年01期

4 張振生,買凱;乙型肝炎病毒(adw_2)亞型全基因組的分子克隆[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);1988年04期

5 夏翔,沈龍柱,李秀松;32例瘀膽型肝炎療效分析[J];上海中醫(yī)藥雜志;1988年01期

6 葉欣 ,鄧承軍;短期體外試驗預(yù)測Ⅱ期肺腺癌病人的臨床化療效果[J];國際腫瘤學(xué)雜志;1988年06期

7 梁婭玲;陳式琦;;嬰兒肝炎綜合征116例分析[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1988年01期

8 徐德啟;董偉;于萬龍;賈國富;;DNA分子雜交技術(shù)在乙肝(血源)疫苗質(zhì)量監(jiān)測中的應(yīng)用[J];中國生物制品學(xué)雜志;1988年00期

9 楊啟超;甘俊;周美嬌;嚴(yán)瑞琪;蘇建家;黃定瑞;楊春;黃國華;;肝靈對感染乙型肝炎病毒樹鼩的療效觀察[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);1988年01期

10 黃天衛(wèi);傅永潛;張先灼;穆燕;王培英;;肝硬化病人HBV血清學(xué)標(biāo)記檢測的臨床意義[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1988年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 朱寧希;白血病多藥耐藥相關(guān)基因的研究[D];浙江大學(xué);2001年

2 陳少驥;腸系膜下動脈微栓塞化療及結(jié)腸癌多藥耐藥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2001年

3 王新;胃癌SGC7901細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)新蛋白和基因的篩選及鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 韓英;胃癌細(xì)胞耐藥相關(guān)分子的表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和離子通道特性的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

5 陳杰;人肺腺癌多藥耐藥細(xì)胞差異表達基因的克隆與初步鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 熊瑋;人肺癌染色體畸變及其與耐藥關(guān)系的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2001年

7 李玉皓;眼眶橫紋肌肉瘤多藥耐藥機制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2002年

8 胡文華;人鈣周期素結(jié)合蛋白（hCacyBP）編碼基因在胃癌細(xì)胞多藥耐藥形成中的作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

9 趙燕秋;腫瘤耐藥的分子機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

10 時永全;胃癌耐藥相關(guān)分子Mgr1-Ag編碼基因的克隆、鑒定與功能分析[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 傅全勝;Bcl-2基因表達與人腎細(xì)胞癌株多藥耐藥關(guān)系的體外實驗研究[D];暨南大學(xué);2000年

2 夏春燕;P-糖蛋白、Bcl-2、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶π在預(yù)測乳腺癌的多藥耐藥性及激素治療方面的意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2000年

3 但漢雷;乳腺癌耐藥細(xì)胞HLA和B7表達及其調(diào)控的初步研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

4 高敢攀;N取代吩噻嗪衍生物的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性研究[D];上海醫(yī)藥工業(yè)研究院;2000年

5 姚學(xué)清;人大腸癌多藥耐藥細(xì)胞株LOVO/5-FU的建立及其生物學(xué)特性的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

6 王利;人參皂甙逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥性的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2001年

7 呂懷慶;喉癌患者多藥耐藥基因及多藥耐藥相關(guān)蛋白基因的表達及其臨床意義[D];青島大學(xué);2001年

8 遲作華;肺耐藥蛋白基因在惡性血液病中的表達及意義[D];青島大學(xué);2001年

9 羅志國;非小細(xì)胞肺癌中P-糖蛋白的表達及意義[D];江西醫(yī)學(xué)院;2001年

10 沈蔚;P糖蛋白在膽囊癌中的表達及其與P53蛋白表達相互關(guān)系[D];浙江大學(xué);2001年

本文編號：2864958