目的 丙型肝炎病毒(HCV)在人體內以準種的形式存在。HCV準種感染是導致丙型肝炎慢性化和影響干擾素療效的重要原因之一。本研究分別對應用干擾素治療的慢性丙型肝炎患者HCV基因組中高變區(qū)1(HVR1)和非結構區(qū)5A(NS5A)進行了準種檢測，以探討HCV準種感染與干擾素療效之間的關系，是否可以對干擾素治療進行療效預測，以及HCV準種異質性與HCV RNA含量之間的相互關系，為臨床選擇應用干擾素抗病毒治療適應癥及預測療效提供理論依據。 材料與方法 研究對象：應用干擾素治療的HCV RNA陽性的慢性丙型肝炎患者共20例，男15例，女5例。年齡23-45歲。干擾素治療方案：α-干擾素3MU，3次／周肌肉注射，共24周。療效判定：治療結束時，ALT正常、HCV RNA陰轉為暫時應答；ALT正常、HCV RNA陰轉持續(xù)至治療結束6個月以上為持續(xù)應答，否則為無應答。留取治療前血清，-70℃凍存?zhèn)溆谩?HCV HVR1及NS5A基因片斷擴增：采用巢式逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)。分別在HVR1及NS5A兩側保守區(qū)設計PCR引物。首先應用常規(guī)的HCV RNA提取方法—異硫氰酸胍-酚-氯仿提取法從血清中提取HCV RNA，然后經過逆轉錄及兩輪PCR反應，擴增出HVR1及NS5A區(qū)基因片斷。 HCV基因分型：分別采用型特異性PCR法及核苷酸序列測定法。型特異性PCR法為在C區(qū)設計公共的上游引物及4條型特異性下游引物，進行RT-PCR擴增，依據PCR產物電泳結果直接區(qū)分HCV四種基因型。核苷酸序列測定法：應用直接測序法對NS5A區(qū)進行核苷酸序列測定，依此進行基因型的劃分。 HVR1區(qū)準種異質性檢測：采用克隆測序法。HVR1區(qū)PCR陽性產物純化后，與載體質粒進行連接，然后轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，通過培養(yǎng)選擇陽性菌落，每份標本挑取10個陽性克隆，進行重組質粒提取，經PCR驗 證后進行核昔酸序列測定。 NSSA區(qū)準種檢測：采用直接測序法。NSSA區(qū) PCR陽性產物純化后， 直接進行核谷酸序列測定。 HCV RNA定量檢測：應用特異性熒光探針PCR法。采用PCR方法結 合熒光探針的擴增檢測技術，通過檢測PCR反應體系中熒光強度的變化， 并根據純化HCV RNA建立標準曲線，即可推算出樣本中 HCV RNA含量。 實驗結果 1．HVRI及 NSSA基因片斷的擴增 經RT－PCR擴增的HCV HVRI及NSSA 基因片斷大小分別為388hP 和573hp，電泳結果見圖1。 2．HCV基因分型 20例患者應用型特異性PCR法分型結果為：DO）型14例（7％X 皿p叫型4例＊0％XJ和皿混合型2例O％八電泳結果見圖2。對上 述患者中 12例 11型患者應用直接測序法進行了分型，結果 12例 11型患者 中除1例為k型外，其余均為幾型（見圖3人兩種檢測方法一致性為 gi．7阮。 3．HVRI準種異質性與干擾素療效的關系 對7例幾型患者進行了克隆測序，其中3例為持續(xù)應答者／例為無 應答者。每份血清挑取10個陽性克隆，共獲得了63個克隆的序列，氨基酸 序列結果見圖4。HVRI準種的復雜性（準種數）在無應答組明顯高于持續(xù) 應答組＊＝6．737，P＜0．ofL見表 1。HVRI準種基因的差異性（nucleohde diversity）以每個基因位點的平均變異率來表示。無應答組平均每個位點的 核昔酸及氨基酸變異率均明顯高于持續(xù)應答組，見表2。 4．fo型 HCVNSSA基因變異與干擾素療效的關系 NS5A2209－2248區(qū)核苛酸序列分析Jl例fo型患者干擾素治療前核昔酸 序列情況見表4。其中3戶號患者為持續(xù)應答者，余為無應答者，兩組之間 核耷酸變異數無顯著差異＊＝0．86，P＞0．05人與 HCV＊相比，變異數 未超過10％，且多為同義突變，表明NSSA區(qū)高度保守。 NSSA。0。s區(qū)氨基酸序列變異與于擾素療效的關系：按照Enomoto的 分型方法，11例fo型患者豆例為中間型，余均為野生型，未見突變型。 fZ· NSS A。隊。區(qū)氨基酸序列變異與于擾素療效無關。結果見圖 5。 干擾素治療對 NSS A基因變異的影響：對 5號患者的動態(tài)觀察發(fā)現，于 擾素治療后NSSA基因發(fā)生了變異，導致其在基因樹中位置改變。（圖3中 5刁j－義5－3X即引起了其準種的改變，并未導致基因型的變化。核昔 酸變異大多為同義突變。氨基酸變異情況見圖6。 4．HCV準種復雜性與HCV RNA含量的關系 HCV準種復雜性與 HCV RNA含量無顯著相關性卜＝0．432，p＞ 0．05），見表3。 結 論 1．沈陽地區(qū)慢性丙型肝炎患者以感染 fo型 HCV為主。應用型特異 性PCR法與核昔酸序列測定法所得的結論基本一致。 2．HCV HVRI區(qū)準種異質性（包括復雜性與基因的差異性）與干擾素 療效有關，異質性程度越高對干擾素無應答的可能性越大。 3．HCV NSSA基因片斷具有高度保守性，NSSA＿．＿區(qū)氨基酸變異與 干擾素療效無關。在中國丙型肝炎患者中是否存在所謂的干擾素敏感決定 區(qū)門SDR）有待進一步探討。 4．HVRI準種的復雜性與HCV RNA含量無明顯相關性，是預測干擾 素療效的獨立因素之一。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R512.6
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語
四、 前言
五、 論文一
六、 論文二
七、 論文三
八、 本研究創(chuàng)新點
九、 參考文獻
十、 致謝
十一、 論文綜述
十二、 個人簡介
十三、 在學期間發(fā)表論文

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

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本文編號：2864860