目的探討TLR2單克隆抗體(Toll like receptor 2 monoantibody, TLR2mAb)和TLR4單克隆抗體(Toll like receptor 4 monoantibody, TLR4mAb)對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。 方法50只雄性BALB/c小鼠分為A～E組：對照組(A組)、UC模型組(B組)及TLR2mAb干預(yù)組(C組)、TLR4mAb干預(yù)組(D組)、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組(E組)。A組小鼠飲用蒸餾水7天；B-E組小鼠僅飲用5%DSS水溶液7天以產(chǎn)生急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型。于造模第1、3、5、7天進(jìn)行干預(yù),C、D、E干預(yù)組小鼠分別給予TLR2mAb(10μg)、TLR4mAb(10μg)、TLR2mAb(10μg)+TLR4mAb(10μg)腹腔內(nèi)注射,A、B組給予腹腔內(nèi)注射生理鹽水,以觀察TLR2mAb和TLR4mAb的干預(yù)作用。觀察指標(biāo)包括疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)評分(histopathological score, HS)。造模及干預(yù)7天后處死小鼠,采用Realtime-PCR法檢測各組結(jié)腸黏膜TLR2、TLR4、IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表達(dá),Western-Blot法檢測各組腸粘膜磷酸化p38αMAPK、c-jun、c-fos、磷酸化IKK蛋白表達(dá),EMSA法檢測NF-κB的活性變化。 結(jié)果 第一部分TLR2mAb和TLR4mAb對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎癥狀及病理改變的影響： 造模結(jié)束時,模型組小鼠產(chǎn)生典型的腹瀉、血便、體重減輕等潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn)。對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組的DAI分別為0.50±0.707、9.70±2.406、6.75±3.495、7.75±3.919、5.70±3.498。模型組DAI明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組DAI明顯低于模型組(P0.05),且明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組DAI與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組的HS分別為6.40±3.273、16.50±2.991、13.25±3.576、14.50±3.625、9.50±3.308。模型組HS明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組HS明顯低于模型組(P0.01)和TLR4mAb干預(yù)組(P0.05),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組HS與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 第二部分TLR2mAb和TLR4mAb對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜細(xì)胞因子的影響： 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜TLR2mRNA表達(dá)量如下：0.26±0.397、1.96±1.558、0.64±1.030、0.39±0.594、0.42±0.461。模型組TLR2mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組TLR2mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P0.05),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜TLR4mRNA表達(dá)量如下：0.52±0.414、1.16±0.568、0.45±0.346、0.51±0.374、0.44±0.335。模型組TLR4mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組TLR4mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P0.01,P0.05,P0.01),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜IFN-γmRNA表達(dá)量如下：0.80±0.802、2.40±1.089、0.95±1.075、0.97±0.716、0.93±0.661。模型組IFN-γmRNA表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組IFN-γmRNA表達(dá)明顯低于模型組(P0.05,P0.05,P0.01),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜IL-4mRNA表達(dá)量如下：0.12±0.107、0.86±1.185、0.02±0.025、0.02±0.025、0.03±0.024。模型組IL-4mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P0.05); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組IL-4mRNA表達(dá)明顯低于模型組和對照組(P0.01)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜IL-17mRNA表達(dá)量如下：0.18±0.230、0.61±0.296、0.18±0.236、0.17±0.197、0.06±0.039。模型組IL-17mRNA表達(dá)明顯高于對照組復(fù)旦大學(xué)碩士論文(P0.01)；TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組IL-17mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P0.01),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 第三部分TLR2mAb和TLR4mAb對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎TLR2和TLR4共同介導(dǎo)的信號通路的影響： 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜磷酸化P38αMAPK蛋白表達(dá)量如下：0.45±0.037、1.42±0.131、1.57±0.068、0.89±0.033、0.75±0.024。模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組磷酸化P38αMAPK蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P0.01)；TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P0.01),TLR2mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)與模型組無明顯差異(P0.05)；TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜c-jun蛋白表達(dá)量如下：0.28±0.060、1.17±0.074、1.00±0.078、0.75±0.183、0.42±0.062。模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組c-jun蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P0.01), TLR2mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)與模型組無明顯差異(P0.05)；TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜c-fos蛋白表達(dá)量如下：0.46±0.013、0.48±0.010、0.46±0.017、0.45±0.012、0.45±0.015。組間均無明顯差異(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜磷酸化IKK蛋白表達(dá)量如下：0.11±0.022、0.66±0.013、0.34±0.014、0.18±0.010、0.14±0.013。模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組磷酸化IKK蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb、TLR4mAb、TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P 0.01); TLR4mAb、TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)明顯低于TLR2mAb干預(yù)組(P0.01)；TLR2mAb+TLR4mAb干預(yù)組蛋白表達(dá)與對照組無明顯差異(P0.05)。 對照組、模型組、TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組小鼠腸黏膜NF-κB的活性如下：5.18±0.685、21.24±1.150、18.13±1.451、6.15±0.429、6.12±0.575。模型組NF-κB表達(dá)明顯高于對照組(P0.01); TLR2mAb干預(yù)組、TLR4mAb干預(yù)組、TLR2mAb和TLR4mAb聯(lián)合干預(yù)組IL-17mRNA表達(dá)明顯低于模型組(P0.01),與對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論DSS誘導(dǎo)的急性期潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜的TLR2和TLR4表達(dá)明顯高于正常。TLR2mAb和HR4mAb聯(lián)合干預(yù)可以緩解潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腹瀉、血便、體重下降的癥狀,減輕結(jié)腸黏膜組織炎癥反應(yīng),下調(diào)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的表達(dá),并降低信號傳導(dǎo)通路中磷酸化P38αMAPK、c-jun、磷酸化IKK及NF-κB蛋白表達(dá),故對DSS誘導(dǎo)的小鼠急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型有一定的干預(yù)作用,且二者有協(xié)同作用。TLR2mAb主要通過抑制NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),而TLR4mAb主要通過抑制P38MAPK-c-jun通路和NF-κB通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),從而抑制下游細(xì)胞因子過度表達(dá),減輕小鼠結(jié)腸黏膜炎癥損傷。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R574.62
【部分圖文】：

討論一、TLRZmAb和TLR4InAb對急性UC模型小鼠腸薪膜TLRZ、TLR4表達(dá)的影響Toll樣受體(TLRs)是一族具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的天然免疫識別受體(PatterReC。gniti。nReC即t。rs，PRR)，主要識別病原微生物所共有的高度保守的病原關(guān)分子模式(pathogenaSS。Ciatedm。leCularpattern，PAMP)。不同的TLRS可識別不同的以MP，TLRZ與TLRI或TLR6形成異二聚體，主要識別革蘭陽性菌的膚糖(PGN)和磷壁酸(LTA)，TLR4與CD14、LBP結(jié)合主要識別革蘭陰性菌脂多糖(LP!‘:，’〕。TLRS分布也十分廣泛，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、形核細(xì)胞、T與B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及腸道上皮細(xì)胞等。最近研究表明生理狀態(tài)下正常的TLRS信號傳導(dǎo)通路可以維持腸勃膜的完整和對共生微生物的內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài);而在病理情況下，該信號傳導(dǎo)通路的異常表達(dá)會導(dǎo)致結(jié)腸勃膜的急、慢性

復(fù)旦大學(xué)碩士論支架及膠放入電泳槽中，上下槽各加入TriS一甘氨酸電泳緩沖液;通電源，以電壓120V、電流60mA電泳，等到澳酚藍(lán)跑出分離膠即可電泳。.3WesternBloting實驗流程:的處理:小心將膠放入100mL陰極buffer，平衡15min;的處理:用尺子量作膠的大小，剪同樣大小的一片PVDF膜，用甲醇()浸泡155，再用雙蒸水浸泡Zmin，取出用陽極bufferll平衡IOmin干法轉(zhuǎn)膜:按下面順序放膠、膜和濾紙，插上電源，1.ZmA/cmZ轉(zhuǎn)膜................一陰極
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2861060