肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extraceilularmatrix，ECM)彌漫性過度沉積的病理過程，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)。隨著肝臟病變的發(fā)展,肝細(xì)胞壞死,肝實(shí)質(zhì)彌漫性結(jié)節(jié)再生,膠原纖維大量沉積,最終導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)改變,發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化在去除損傷因子后是可以逆轉(zhuǎn)的，表現(xiàn)為膠原纖維沉積減少，肝組織病理程度減輕以及肝臟功能的恢復(fù)。而肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)在肝損傷和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡成為促進(jìn)肝纖維化恢復(fù)的重要途徑之一。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族新成員，可選擇性的誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化恢復(fù)期，KC及活化的HSC可通過誘導(dǎo)TRAIL及其他凋亡刺激因子從而促進(jìn)HSC的凋亡，促進(jìn)ECM的降解，從而促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)是繼死亡受體活化和線粒體損傷之后第三條介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路。在缺氧、氧化應(yīng)激、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊的蛋白質(zhì)會(huì)明顯增多，當(dāng)超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，細(xì)胞激活相關(guān)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)應(yīng)對(duì)外界條件變化，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)良好的蛋白質(zhì)折疊環(huán)境，即啟動(dòng)ERS，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂。ERS作為一條新的細(xì)胞信號(hào)凋亡傳導(dǎo)通路，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，與肝損傷、肝癌等多種肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但ERS在肝纖維化形成與逆轉(zhuǎn)過程中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過采用CCl4誘導(dǎo)大鼠建立肝纖維化動(dòng)物模型，研究ERS相關(guān)蛋白在肝纖維化病程中的動(dòng)態(tài)變化情況，探討ERS在肝纖維化病程中的作用。并在此基礎(chǔ)上通過體外研究，進(jìn)一步探索ERS與TRAIL在大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的相互關(guān)系，研究主要包括以下幾部分： 1.大鼠肝纖維化模型中ERS相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化 采用CCl4皮下注射12周建立大鼠肝纖維化模型，病理學(xué)HE染色及VG膠原染色顯示，模型大鼠肝組織可見大量膠原纖維沉積擴(kuò)展至小葉邊緣，纖維間隔增厚，出現(xiàn)大量脂肪空泡。停止注射CCl44周、8周，肝組織纖維沉積程度明顯降低，脂肪空泡減少，纖維間隔變小、變窄。提示在CCl4注射12周誘發(fā)肝纖維化模型建立成功，停止CCl4皮下注射4周、8周后，大鼠肝纖維化有自發(fā)的逆轉(zhuǎn)傾向。 免疫組化檢測(cè)ERS相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，正常肝組織中ERS標(biāo)志性蛋白CHOP和GRP78胞質(zhì)淡染，表達(dá)較少。隨著肝纖維化的形成，模型組CHOP和GRP78著色顯著加深，陽性表達(dá)明顯高于正常組，提示ERS反應(yīng)與大鼠肝纖維化密切相關(guān)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)停止注射CCl44周、8周，肝纖維化進(jìn)入逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期，此時(shí)CHOP、GRP78陽性表達(dá)隨之降低，與模型組相比染色減淡，顯示伴隨著肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，ERS反應(yīng)程度減輕。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果亦顯示，CHOP、GRP78mRNA水平在肝纖維化模型期明顯上調(diào)。與模型組相比，隨著恢復(fù)4、8周纖維化病變程度減輕，CHOP、GRP78mRNA表達(dá)有所降低。提示肝纖維化啟動(dòng)了ERS反應(yīng)，ERS參與了大鼠肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展、逆轉(zhuǎn)，并在此過程中發(fā)揮著重要作用。Westernblot結(jié)果均與上述一致。以上結(jié)果提示，ERS存在于大鼠肝纖維化進(jìn)程中，可能與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展、逆轉(zhuǎn)存在密切聯(lián)系。 2.體外實(shí)驗(yàn)研究ERS與TRAIL在大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的關(guān)系及部分機(jī)制研究 體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，以毒胡蘿卜素（Thapsigargin，TG）作為ERS誘導(dǎo)劑，熊去氧膽酸（Ursodeoxycholicacid，UDCA）為ERS抑制劑，SP600125作為JNK抑制劑，應(yīng)用小分子RNA干擾技術(shù)沉默CHOP基因。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著TG濃度增加（1μM，2μM，4μM，8μM，16μM），可誘導(dǎo)HSC-T6發(fā)生不同程度的凋亡；RT-PCR與Westernblot結(jié)果表明ERS標(biāo)志性蛋白CHOP可誘導(dǎo)TARIL受體DR5的表達(dá)明顯上調(diào)。同時(shí)，siCHOP及JNK抑制劑SP600125的應(yīng)用，均可使HSC細(xì)胞中DR5的表達(dá)隨之減少。以上結(jié)果表明CHOP和JNK可能是調(diào)節(jié)DR5表達(dá)的潛在因子，兩者之間的密切關(guān)系在星狀細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要的作用。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明了ERS參與了大鼠肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展、逆轉(zhuǎn)進(jìn)程，并在此過程中發(fā)揮了重要作用；證明了TG可誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞發(fā)生ERS進(jìn)而引起凋亡；發(fā)現(xiàn)ERS與TRAIL在HSC-T6凋亡機(jī)制中存在著一定的聯(lián)系。CHOP和JNK可能是調(diào)節(jié)DR5表達(dá)的潛在因子，對(duì)于TRAIL受體DR5的調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【文章目錄】：
英文縮略詞
中文摘要
Abstract
第一部分 大鼠肝纖維化進(jìn)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化研究
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
    3 實(shí)驗(yàn)方法
    4 結(jié)果
    5 討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 ERS 與 TRAIL 在大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡中的關(guān)系及部分機(jī)制
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
    3 實(shí)驗(yàn)方法
    4 結(jié)果
    5 討論
    參考文獻(xiàn)
結(jié)論
附錄
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2860877