第一部分腸道內(nèi)環(huán)境因素通過維生素D受體調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細胞屏障功能及機制的初探目的:探究維生素D受體(Vitamin D Receptor,VDR)調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細胞系屏障功能作用及其受腸道內(nèi)部分環(huán)境因素(低氧及丁酸)影響的相關(guān)機制。方法:1.VDR敲降細胞系實驗:1).采用Western blot法及RT-PCR法篩選兩種高表達VDR的結(jié)腸上皮細胞系DLD-1和Caco2;2).采用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)對兩種細胞系進行VDR基因敲降,構(gòu)建各自的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系Sh-VDR(Small Hairpin-VDR)及對照 Sh-NC(Small Hairpin-Normal Control);3).跨膜電阻抗法(Transepithelial Electric Resistance,TEER)檢測 DLD-1 VDR 敲降細胞系單層細胞完整性;4).Western blot法檢測DLD-1,Caco2敲降細胞系緊密連接(Tight Junction,TJ)蛋白 Zo-l,Occludin 和黏合連接(Adhesive Junction,AJ)蛋白E-cadherin表達。2.體外低氧刺激VDR敲降細胞實驗:1).將DLD-1分別給予低氧(1%O2)、維生素D(100 nM)及低氧聯(lián)合維生素D處理48h。Western blot法檢測各組細胞中緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Zo-1,Occludin,Claudin-l和黏合連接蛋白E-cadherin及VDR的表達情況;2).對DLD-1的VDR敲降細胞系Sh-VDR及對照Sh-NC,給予低氧處理48h,檢測上述蛋白的表達情況。3.體外丁酸刺激VDR敲降細胞實驗:1).分別給予濃度為0.3mM-3miVJ丁酸處理DLD-1細胞48h,采用 RT-PCR 及 Western blot 法檢測各組細胞中 Zo-1,0ccludin,E-cadherin 及VDR在mRNA水平及蛋白水平的表達情況；2).對DLD-1 Sh-VDR及對照Sh-NC,以0.3mmM 丁酸處理24h后,RT-PCR法檢測各組細胞上述蛋白的表達情況。結(jié)果:1.VDR敲降細胞系實驗:1).與對照組Sh-NC相比,DLD-l,Caco2 VDR基因敲降后TJ蛋白Zo-1,0ccludin及AJ蛋白E-cadherin表達均明顯降低(n=5,P0.001);2).DLD-1敲降組Sh-VDR細胞系連續(xù)培養(yǎng)7天及11天后跨膜電阻抗值顯著降低(n=3,22.0±3.28 vs.4.33±1.73，P=0.009;n=3,21.0±1.86 vs.9.33±0.58,P=0.004)。2.體外低氧刺激VDR敲降細胞實驗·:1).與常氧條件培養(yǎng)的DLD-1對照組相比,DLD-1低氧處理48 h后緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Occludin,Claudin-1及VDR表達增加(n=3，P0.001),低氧+維生素D聯(lián)合處理組較單獨維生素D處理組,除上述蛋白表達增加外,Zo-1及E-cadherin表達也明顯增加(n=3，P0.001)；2).與未處理 DLD-1 Sh-VDR 組相比,DLD-1 Sh-VDR 細胞低氧處理后,Zo-1,Occludin,Claudin-1及E-cadherin表達均顯著降低(n=3，P0.001，P0.001，P0.001，P0.01)。3.體外丁酸刺激 VDR 敲降細胞實驗:1).與空白對照組相比,DLD-1在0.3mmM 丁酸處理48 h后緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白Zo-1,Occludin和黏合連接蛋白E-cadherin及VDR表達在蛋白水平及mRNA 水平均顯著增加(n=3，P0.001，P0.001,10.001，P0.001)；2).與 DLD-1 Sh-NC和Sh-VDR空白對照組相比,DLD-1 Sh-NC及Sh-VDR細胞0.3mM 丁酸處理24h后,Zo-1,Occludin,E-cadherin 表達在 mRNA 水平均顯著增加(P0.001,P0.01,P0.001),Sh-VDR細胞丁酸處理后VDR在mRNA水平也顯著增高(P0.001)。結(jié)論:1.VDR敲降后,結(jié)腸上皮細胞系DLD-1,Caco2單層細胞屏障功能減低;2.低氧和菌群代謝產(chǎn)物丁酸可通過VDR調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細胞屏障蛋白;3.VDR對于低氧狀態(tài)下結(jié)腸上皮細胞系DLD-1腸上皮屏障蛋白表達有調(diào)節(jié)作用,提示VDR通路可能為腸道低氧環(huán)境下保護腸黏膜屏障的重要機制之一。第二部分利用VDR敲除小鼠探究VDR調(diào)節(jié)腸黏膜屏障相關(guān)機制目的:利用VDR敲除(VDR Knock-out,VDR KO)小鼠探究VDR對腸黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)作用。方法:1.VDR KO小鼠:1).利用CRISPR/spCas9技術(shù)構(gòu)建C57BL/6品系VDR基因敲除首建鼠(Founder),采用后代中8-10周VDR KO純合子VDR(-/-)及其同窩野生型(Wild Type,WT)對照VD(+/+)進行后續(xù)實驗;2).小鼠活體共聚焦顯微鏡下熒光素滲漏實驗檢測VDR KO小鼠及WT對照小鼠結(jié)腸黏膜屏障通透性變化;3).Western blot法檢測VDR KO小鼠及其WT對照小鼠結(jié)腸黏膜TJ蛋白Zo-1,Occludin和AJ蛋白E-cadherin在蛋白水平變化；4).16S V3-V4區(qū)測序法檢測VDR KO小鼠及WT對照小鼠糞便菌群變化。2.VDR KO小鼠建立DSS模型實驗方法:1).動物實驗分組:8-10周WT VDR(+/+)及VDR KO小鼠VDR(-/-)分別分為對照組(Ctrl)和 DSS 處理組(DSS),即 Ctrl 組(n=4),Ctrl+DSS 組(n=4),K0組(n=4)及KO+DSS組(n=4),DSS處理組給予質(zhì)量分數(shù)為1.5%的DSS飲用水5天,期間每日監(jiān)測體重、大便性狀及便潛血,選擇第7天(D7)做為觀察終點,記錄結(jié)腸長度,大體評分及評估病理評分;2).用小鼠活體共聚焦熒光顯微鏡檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜屏障通透性變化;3).電鏡觀察小鼠結(jié)腸上皮間連接結(jié)構(gòu);4).用Western Blot法檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜TJ蛋白Occludin表達差異。結(jié)果:1.VDR KO小鼠:1).小鼠活體熒光素滲漏實驗顯示與WT組相比,VDR KO組小鼠結(jié)腸黏膜通透性增加,滲透評分顯著增高(n=3,0±0 vs.1.1±0.74,P0.0001);2).電鏡下(20000×)表現(xiàn)為KO組小鼠結(jié)腸上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)不完整,邊緣模糊,提示結(jié)腸屏障功能已部分受損;3).VDR KO組小鼠屏障蛋白Zo-1、Occludin和E-cadherin表達均明顯降低(n=3,P0.001);4).小鼠糞便菌群16S V3-V4區(qū)測序結(jié)果顯示:有兩種與纖維降解相關(guān),可產(chǎn)生包括丁酸,乙酸在內(nèi)的短鏈脂肪酸的Ruminiclostridium及Anaerotruncus菌屬在VDR KO組小鼠糞便中表達減低(n=5;P=0.023,P0.029),同為專性厭氧菌的Desulfovibrio及Odoribacter在VDR KO組小鼠糞便中表達也明顯減低(P=0.041,P=0.003)。2.VDR KO小鼠建立DSS模型實驗結(jié)果:1).1.5%DSS處理后D7天,與KO組相比,KO+DSS組小鼠疾病活動指數(shù)顯著增高(0.25±0.50 vs.3.75±0.17,P=0.015),大體評分顯著升高(0±0 vs.3.75±0.25，P=0.011),結(jié)腸長度明顯縮短(7.72±0.17 vs.5.24土0.40,P0.001);病理學(xué)評分也顯著增高(0±0 vs.22±2.48，P=0.014);小鼠結(jié)腸活體共聚焦熒光顯微鏡觀察KO+DSS組結(jié)腸黏膜選擇性通透功能幾乎完全喪失,滲透評分升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022);電鏡顯示KO+DSS組小鼠結(jié)腸上皮間TJ及AJ結(jié)構(gòu)嚴重破壞甚至消失;Western blot 法檢測 KO+DSS 組 TJ 結(jié)構(gòu) Occludin 表達減低(P0.001)。2).與Ctrl+DSS組相比,KO+DSS組大體評分顯著升高(2.50±0.29 vs.3.75±0.25,P=0.032),結(jié)腸短縮十分明顯(6.83±0.23 vs.5.24±0.40，P=0.006);病理學(xué)評分顯著增高(8.25±1.80vs.22.0±2.48，P=0.021),滲透評分也顯著升高(1.2±0.13 vs.1.8±0.13,P=0.023),電鏡表現(xiàn)同前,Western blot 法檢測Occludin蛋白表達減低(P0.001)。結(jié)論:1.小鼠VDR基因敲除后,結(jié)腸黏膜屏障功能受損,糞便中產(chǎn)短鏈脂肪酸如丁酸的有益細菌顯著減少;2.在較低濃度DSS處理后VDR KO小鼠結(jié)腸炎及屏障損傷表現(xiàn)更重伴上皮修復(fù)功能障礙;3.VDR的存在對結(jié)腸黏膜屏障功能及損傷修復(fù)有重要保護作用。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R57
【部分圖文】：
Ｃａｃｏ２細胞ＶＤＲ表達，以及人胚胎腸黏膜組織來源細胞ＣＣＣ－ＨＩＥ。在ＲＴ－ＰＣＲ中，??可見ＳＷ４８０，?ＤＬＤ－１及Ｃａｃｏ２三種結(jié)腸癌細胞系ＶＤＲ表達較強，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??法驗證上述三種結(jié)腸癌細胞系ＶＤＲ均有明顯表達（見圖１?），選擇ＤＬＤ－１及Ｃａｃ〇２??兩種細胞系進行后續(xù)實驗（ｎ?＝?３）。??Ａ?Ｂ??Ａ?§?＾?￣?ｏ??ＶＤＲ?＃?｜?＾?｜??＾?Ｖ．４〇／?Ｄ〇ｒ＼Ｕ；??｜?＿?３．?ＧＡＰＤＨ??ｕ＞＾?Ｅ?（３５ＫＤ）??蘭?ｋ?Ｓ?〇－?＿?４－，?ｍ?ｓｖ／４８〇??ｗ?？?＜?Ｌ?ｃｆ?麵［＞〇）－ｉ??２５０?１１?３．?；ｒ?■?＿??〇?￣?－?ｍｍ?ｕ?１?歡馨?ＳＷ６２０??ｉｓ?Ｚ?［?ｓ＂｜?２－：??￡｜?〇Ｗ?．，＿—，—ｍ?ｎ?ｊ：：：．?１?■－??Ｚ?ｃ／?Ｚ?ｃ／??Ｃ／?ｃｄｉ?ｌｉｎｅｓ??ｃｅＨ?ｌｉｎｅｓ??圖１：各種結(jié)腸上皮細胞系ＶＤＲ表達情況??注：圖１Ａ，Ｂ分別示ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ法檢測結(jié)腸癌細胞系ＳＷ６２０，??ＳＷ４８０
士標準誤（Ｉ土ＳＥＭ）表示，兩組間比較用兩獨（ＴｆｆｉＲ）法檢測ＤＬＤ－１細胞系ＶＤＲ敲降后黏膜屏障ｅｌｌ小室中分別接種ＤＬＤ－１?Ｓｈ－ＮＣ和Ｓｈ－ＶＤＲ細，連續(xù)培養(yǎng)７天，分別檢測兩組細胞跨膜電阻抗值ｈ－ＶＤＲ細胞跨膜電阻抗值均顯著降低（２２±５．６９?ｖｓ續(xù)培養(yǎng)１１天，Ｓｈ－ＶＤＲ細胞跨膜電阻抗值也顯著０，片０．００４），見圖?３?（ｎ＝３）。??Ｄ?ＬＤ－１??
?圖９?丁酸對ＤＬＤ－１黏膜屏障蛋白表達的影響??注：圖９Ａ，?Ｂ，?Ｃ分別示ＲＴ－ＰＣＲ檢測０．?３ｍＭ及３ｍＭ?丁酸處理４８ｈ對ＤＬＤ－１細??胞?Ｚ〇－ｌ，?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，?Ｏｃｃｌｕｄｉｎ?在?ｍＲＮＡ?水平表達的影響；Ｄ?圖示?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ??法檢測?０．?３ｍＭ，?０？?６ｍＭ?及?３ｍＭ?丁酸處理?４８ｈ?對?ＤＬＤ－１?細胞?Ｚｏ－１，?Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，??Ｏｃｃｌｕｄｉｎ在蛋白水平表達的影響??４０??
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本文編號：
2860808
