背景:我國(guó)是肝病流行較為嚴(yán)重的國(guó)家,肝纖維化是慢性肝病的共同病理改變過(guò)程,其主要表現(xiàn)為膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝臟內(nèi)過(guò)度沉積。肝纖維化若未能得到有效控制,可導(dǎo)致肝硬化,甚至肝癌,最終導(dǎo)致死亡。迄今為止,尚無(wú)特效藥物逆轉(zhuǎn)肝纖維化過(guò)程,因此,闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)理對(duì)預(yù)防和治療肝纖維化具有重要意義和臨床應(yīng)用前景。有研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與肝纖維化的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。ERS傳感器需肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1 alpha,IRE1α)在小鼠肝纖維化模型中最早被激活,激活后的IRE1α具有蛋白激酶和核糖核酸內(nèi)切酶(endoribonuclease,RNase)雙重活性,其中,IRE1α寡聚化介導(dǎo)的反式自磷酸化反過(guò)來(lái)導(dǎo)致IRE1α的RNase激活。IRE1α的RNase激活不僅可以剪切mRNA,而且可特異性剪切微小RNA。另外,具有藥理學(xué)抑制作用的小分子STF-083010能選擇性抑制IRE1α的RNase活性而不影響其激酶活性。但是,IRE1α的RNase特異性抑制劑STF-083010在肝纖維化發(fā)病過(guò)程中是否發(fā)揮作用仍尚未可知。目的:本研究旨在探討IRE1α的RNase特異性抑制劑STF-083010對(duì)四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響。方法:將6-8周的ICR(CD-1)雄性小鼠(24-26 g)隨機(jī)分成四組:對(duì)照組,單純STF-083010組,CCl_4組,STF-083010+CCl_4組。小鼠腹腔注射CCl_4(0.15 ml/kg,按10%溶于玉米油)每周2次,共8周。在STF-083010+CCl_4組,自第六周開(kāi)始至末次注射CCl_4前2h給予小鼠腹腔注射STF-083010(30 mg/kg),每周2次。末次注射CCl_4八周后剖殺所有小鼠。采用Western blot及RT-qPCR法檢測(cè)IRE1α的RNase激活對(duì)CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響。通過(guò)血清學(xué)、病理組織學(xué)(HE、Sirius red染色和Masson's trichrome染色)及RT-qPCR檢測(cè)IRE1α的特異性抑制劑STF-083010對(duì)肝纖維化小鼠肝臟壞死和炎癥的影響。Western blot及免疫組化法檢測(cè)STF-083010對(duì)小鼠肝臟α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)和分布的影響。另外,RT-qPCR檢測(cè)STF-083010對(duì)小鼠肝臟miR-122及其下游靶基因表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)與模型組比較,Western blot和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示IRE1α的RNase特異性抑制劑STF-083010能夠選擇性抑制小鼠肝臟中IRE1α的RNase激活,但是對(duì)IRE1α激酶活性無(wú)抑制作用;(2)與單純CCl_4組相比,HE染色和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果揭示STF-083010顯著減輕CCl_4處理的小鼠肝臟的壞死和炎癥;(3)與模型組相比,免疫組化結(jié)果證實(shí)STF-083010明顯減少CCl_4處理的小鼠肝臟中α-SMA的表達(dá);(4)與CCl_4組相比,Sirius red和Masson's trichrome染色結(jié)果顯示STF-083010顯著減輕CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化;(5)機(jī)制性探索發(fā)現(xiàn)肝臟miR-122在CCl_4處理的小鼠中顯著下調(diào),而其靶基因如TGF-β1、MCP1、CTGF、P4HA1、Col1α1、Col1α2和Mmp9在CCl_4處理的小鼠中則被上調(diào);有意義地是,STF-083010逆轉(zhuǎn)了CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝臟中miR-122下調(diào),相應(yīng)地,STF-083010顯著抑制CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝臟中miR-122靶基因的上調(diào)。結(jié)論:本研究結(jié)果證明了IRE1α的RNase特異性抑制劑STF-083010減輕了CCl_4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文酸酶激活對(duì) CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響察 IRE1α 的 RNase 激活對(duì) CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響，結(jié)所料，在 CCl4處理的小鼠中，肝臟 IRE1α 的磷酸化水平明顯被83010干預(yù)后并沒(méi)有影響纖維化小鼠肝臟 IRE1α的磷酸化水平（表明，剪接型的X-盒結(jié)合蛋白（1spliced X-box binding protein 1（total XBP1，XBP1t）轉(zhuǎn)錄物的比值（IRE1α RNase 活性的指小鼠肝纖維化中明顯升高。有意義地是，STF-083010 顯著減肝臟 XBP1s/XBP1t 的上調(diào)（圖 1B）。另外，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) STF激的標(biāo)志性蛋白 GRP78 的表達(dá)水平并沒(méi)有影響，從而另一角 是 IRE1α RNase 活性的靶向抑制劑（圖 1C）。本研究結(jié)果 能夠選擇性地抑制 CCl4誘導(dǎo)的肝臟 IRE1α RNase 的激活。

圖 2 STF-083010（STF）對(duì)長(zhǎng)期 CCl4處理后肝臟病理組織學(xué)的影響；B：STF 組；C：CCl4組；D：STF+CCl4組。上圖（A-D）為代表性肝放大倍數(shù)×100，比例尺為：100 μm）。E：每個(gè)載玻片的 12 個(gè)隨機(jī)選擇的數(shù)。F：形態(tài)學(xué)分析以評(píng)估每個(gè)切片中壞死部位的百分比。2 Effect of STF-083010 (STF) on hepatic histopathology following long-termtreatment.ative hepatic histological photomicrographs in mice of control group (A), STFp (C) and combination of STF plus CCl4group (D) are shown in the pictution ×100). Scale bars are 100 μm. The number of inflammatory cells (E) wandomly selected fields from each slide. (F) Morphometric analysis was phe percentage of necrotic site in each section.

圖 3 STF-083010（STF）對(duì)長(zhǎng)期 CCl4處理后肝臟炎性細(xì)胞因子的影響me RT-qPCR 技術(shù)測(cè)量肝臟 TGF-β1 (A)、MCP1 (B)、IL-1β (C)及 IL-6 (Fig. 3 Effects of STF-083010 (STF) on hepatic inflammatory cytokinefollowing long-term CCl4administration.F-β1 (A), MCP1 (B), IL-1β (C) and IL-6 (D) mRNAs were measured u83010 對(duì) CCl4誘導(dǎo)小鼠肝臟 α-SMA 表達(dá)的影響觀察 IRE1α RNase 抑制劑對(duì)纖維化小鼠肝臟 α-SMA 的影響，的標(biāo)志物，結(jié)果如圖 4 所示，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示 α-SM域伴有著橋接纖維化（圖 4C）。進(jìn)一步分析表明，CCl4處理
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本文編號(hào)：2860783