干擾素誘導(dǎo)蛋白DAI抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的初步研究碩士學(xué)位論文中文摘要 乙型肝炎病毒(HBV)是危害人類健康的主要病原體之一,在全球范圍內(nèi),有近四億感染者,由此引發(fā)的肝炎肝硬化以及肝癌每年導(dǎo)致近百萬(wàn)人的死亡。干擾素是一類具有廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子,自其1957年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已經(jīng)受到大量的關(guān)注并被廣泛應(yīng)用到病毒感染的臨床治療中,但是其抑制HBV復(fù)制的機(jī)理還不甚明了。先前的研究表明干擾素可以通過(guò)誘導(dǎo)抗病毒蛋白(MxA,APOBE3,MyD88)的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抑制HBV復(fù)制的作用,但是這些蛋白并不能揭示干擾素抑制HBV復(fù)制的全部機(jī)理,提示還有其他抗乙型肝炎病毒的干擾素誘生蛋白的存在,值得進(jìn)一步尋找新的受干擾素誘導(dǎo)的抑制HBV復(fù)制的蛋白并揭示其抑制HBV復(fù)制的機(jī)理。 基因微點(diǎn)陣芯片技術(shù)(Micro array)的發(fā)展和應(yīng)用使得有可能從新的角度研究干擾素抗病毒的機(jī)制及尋找新的抗病毒蛋白,已經(jīng)有不少利用cDNA基因芯片技術(shù)檢測(cè)經(jīng)干擾素處理后的人類肝細(xì)胞或者試驗(yàn)動(dòng)物的肝細(xì)胞的基因表達(dá)譜的變化,Chisari,F.V等發(fā)現(xiàn),對(duì)有HBV復(fù)制的小鼠肝細(xì)胞(HBVMet4)用干擾素處理六小時(shí)后,IFN-γ和IFN-β可以使DAI (DNA-dependent activator of IFN-regulatory factor,也叫Z-DNA binding protein (ZBP1)或者DLM-1)的表達(dá)量分別升高426和577倍。DAI最初作為一種RNA結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn),其可以與β-actin mRNA的zipcode結(jié)構(gòu)高特異性結(jié)合來(lái)決定β-actin mRNA的細(xì)胞內(nèi)定位從而來(lái)維持細(xì)胞的極性。而后Yineng Fu等發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞DAI可以被IFN-γ或者LPS刺激后上調(diào),被稱為腫瘤基質(zhì)和激活巨噬細(xì)胞蛋白(Tumor stroma and activated macrophage protein),提示在宿主天然防御中發(fā)揮重要的作用。2007年Tadatsugu Taniguchi等證明DAI作為DNA識(shí)別蛋白可以與IRF3和TBK1相互作用并能強(qiáng)烈地誘導(dǎo)Ⅰ干擾素的產(chǎn)生。由此可以推測(cè)DAI可能在干擾素介導(dǎo)的抗HBV復(fù)制中發(fā)揮著重要的作用。 本研究首先證實(shí)了IFN-α可以在肝癌來(lái)源的Huh7細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)DAI的mRNA水平的上調(diào)。隨即將DAI蛋白的表達(dá)質(zhì)粒與HBV的復(fù)制型質(zhì)粒HBV1.3共轉(zhuǎn)Huh7細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)DAI可以明顯地下調(diào)乙肝表面抗原(HBsAg)以及e抗原(HBeAg),細(xì)胞內(nèi)HBV RNA及HBV核心顆粒DNA的水平。鑒于poly(dA-dT).poly(dT-dA) (B-DNA)是一種可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)DAI表達(dá)的人工合成DNA,在HBV的復(fù)制的Huh7細(xì)胞中加入B-DNA可以誘導(dǎo)DAI的表達(dá)并抑制HBV的復(fù)制。由此提示外源性及內(nèi)源性的DAI都可以抑制HBV的復(fù)制。 DAI作為一種誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的重要分子,其對(duì)HBV的抑制作用是否與誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生相關(guān)?研究表明DAI可以與TBK1相互作用后通過(guò)招募干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)進(jìn)而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,其抑制HBV的作用是否與此相關(guān),為此我們首先在Huh7細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)TBK1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其并不能增強(qiáng)DAI對(duì)HBV的抑制作用。進(jìn)而我們將DAI與IRF-3共轉(zhuǎn)細(xì)胞,檢測(cè)IRF-3的活化程度,結(jié)果顯示IRF-3的入核和磷酸化都無(wú)明顯變化,我們將DAI與IRF-3的永久失活體質(zhì)粒(失去N端的DNA結(jié)合區(qū)域的截短體(IRF-3△N))共轉(zhuǎn)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)IRF-3△N并不影響DAI對(duì)HBV的抑制作用,由此提示Huh7細(xì)胞內(nèi)DAI不能激活I(lǐng)RF-3,DAI抑制HBV復(fù)制不依賴于TBK1/IRF-3介導(dǎo)的干擾素產(chǎn)生。 NF-κB是固有抗病毒免疫中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)B-DNA誘導(dǎo)的NF-κB的DNA結(jié)合活性中DAI有重要的作用,本研究的實(shí)驗(yàn)也證明DAI能以劑量依賴的方式激活NF-kB轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性。我們進(jìn)一步應(yīng)用NF-κB的超抑制劑I kBα-SR(superrepressor)發(fā)現(xiàn)可以回復(fù)DAI對(duì)HBV的抑制作用,這提示DAI抑制HBV的活性可能與其激活NF-KB的相關(guān)。 NF-κB活化后可以啟動(dòng)包括干擾素在內(nèi)的抗病毒細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,為探索DAI抑制HBV是否依賴于其對(duì)干擾素的誘生,我們首先在RNA和蛋白水平檢測(cè)DAI在Huh7細(xì)胞內(nèi)能否誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAI不能誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步排除干擾素或者其他分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞因子是DAI發(fā)揮抑制HBV的效應(yīng)因子,我們做了上清置換試驗(yàn),將轉(zhuǎn)染了DAI的細(xì)胞上清加入到HBV復(fù)制的細(xì)胞中,結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)DAI表達(dá)的細(xì)胞上清具有抑制HBV的復(fù)制的效應(yīng)。 綜上所述,本文的結(jié)果證明DAI (ZBP1/DLM-1)是一種具有抗乙型肝炎病毒活性的干擾素誘生蛋白,過(guò)表達(dá)DAI可以下調(diào)HBV RNA,復(fù)制中間體DNA以及e、s抗原水平,這種下調(diào)可能與激活NF-κB的活性相關(guān)但不依賴于它對(duì)干擾素產(chǎn)生的誘導(dǎo)。以上發(fā)現(xiàn)豐富了對(duì)干擾素抗病毒作用機(jī)制的認(rèn)識(shí),為HBV感染的治療提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

0500100020003000400050006000功 seofIFN一aOU八刊)圖1· 1IFN一a可以上調(diào)DAI的RNA水平A.l「N一a處理Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)OAI的轉(zhuǎn)錄水平升高Huh7細(xì)胞鋪板后16小時(shí)，用不同劑量的(0一6000U)的IF閃一a處理6個(gè)小時(shí)，Real一time戶C尺檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)OAI蛋白的尺NA水平。B.l「N。a處理有HBV復(fù)制的Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)OAI的轉(zhuǎn)錄水平升高

0500100020003000400050006000功 seofIFN一aOU八刊)圖1· 1IFN一a可以上調(diào)DAI的RNA水平A.l「N一a處理Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)OAI的轉(zhuǎn)錄水平升高Huh7細(xì)胞鋪板后16小時(shí)，用不同劑量的(0一6000U)的IF閃一a處理6個(gè)小時(shí)，Real一time戶C尺檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)OAI蛋白的尺NA水平。B.l「N。a處理有HBV復(fù)制的Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)OAI的轉(zhuǎn)錄水平升高

HA一DAI一Aeti互1圖3一 1.Real一 timePCR檢測(cè)DAI下調(diào) HBVRNA水平A.Real一 timepCR檢測(cè)DAI下調(diào) HBvRNA水平Huh7種植于12孔板，分4組，每組3副孔，12小時(shí)后每孔轉(zhuǎn)入 HBVI.3質(zhì)粒0.2“g分別轉(zhuǎn)入0， 0.1pg，0.2;g，0.4pg的HA一DA.，不足量用空載補(bǔ)齊，每孔轉(zhuǎn)入 0.109的GFp作為轉(zhuǎn)染效率的參照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)裂細(xì)胞抽RNA
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Michael Kann;André Schmitz;Birgit Rabe;;Intracellular transport of hepatitis B virus[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

本文編號(hào)：2857631