干擾素誘導蛋白DAI抑制乙型肝炎病毒復制的初步研究碩士學位論文中文摘要 乙型肝炎病毒(HBV)是危害人類健康的主要病原體之一,在全球范圍內,有近四億感染者,由此引發(fā)的肝炎肝硬化以及肝癌每年導致近百萬人的死亡。干擾素是一類具有廣譜抗病毒作用的細胞因子,自其1957年被發(fā)現(xiàn)以來已經受到大量的關注并被廣泛應用到病毒感染的臨床治療中,但是其抑制HBV復制的機理還不甚明了。先前的研究表明干擾素可以通過誘導抗病毒蛋白(MxA,APOBE3,MyD88)的表達來發(fā)揮其抑制HBV復制的作用,但是這些蛋白并不能揭示干擾素抑制HBV復制的全部機理,提示還有其他抗乙型肝炎病毒的干擾素誘生蛋白的存在,值得進一步尋找新的受干擾素誘導的抑制HBV復制的蛋白并揭示其抑制HBV復制的機理。 基因微點陣芯片技術(Micro array)的發(fā)展和應用使得有可能從新的角度研究干擾素抗病毒的機制及尋找新的抗病毒蛋白,已經有不少利用cDNA基因芯片技術檢測經干擾素處理后的人類肝細胞或者試驗動物的肝細胞的基因表達譜的變化,Chisari,F.V等發(fā)現(xiàn),對有HBV復制的小鼠肝細胞(HBVMet4)用干擾素處理六小時后,IFN-γ和IFN-β可以使DAI (DNA-dependent activator of IFN-regulatory factor,也叫Z-DNA binding protein (ZBP1)或者DLM-1)的表達量分別升高426和577倍。DAI最初作為一種RNA結合蛋白被發(fā)現(xiàn),其可以與β-actin mRNA的zipcode結構高特異性結合來決定β-actin mRNA的細胞內定位從而來維持細胞的極性。而后Yineng Fu等發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞DAI可以被IFN-γ或者LPS刺激后上調,被稱為腫瘤基質和激活巨噬細胞蛋白(Tumor stroma and activated macrophage protein),提示在宿主天然防御中發(fā)揮重要的作用。2007年Tadatsugu Taniguchi等證明DAI作為DNA識別蛋白可以與IRF3和TBK1相互作用并能強烈地誘導Ⅰ干擾素的產生。由此可以推測DAI可能在干擾素介導的抗HBV復制中發(fā)揮著重要的作用。 本研究首先證實了IFN-α可以在肝癌來源的Huh7細胞內誘導DAI的mRNA水平的上調。隨即將DAI蛋白的表達質粒與HBV的復制型質粒HBV1.3共轉Huh7細胞后,發(fā)現(xiàn)DAI可以明顯地下調乙肝表面抗原(HBsAg)以及e抗原(HBeAg),細胞內HBV RNA及HBV核心顆粒DNA的水平。鑒于poly(dA-dT).poly(dT-dA) (B-DNA)是一種可以強烈誘導DAI表達的人工合成DNA,在HBV的復制的Huh7細胞中加入B-DNA可以誘導DAI的表達并抑制HBV的復制。由此提示外源性及內源性的DAI都可以抑制HBV的復制。 DAI作為一種誘導干擾素產生的重要分子,其對HBV的抑制作用是否與誘導干擾素的產生相關?研究表明DAI可以與TBK1相互作用后通過招募干擾素調節(jié)因子3(IRF-3)進而誘導干擾素的產生,其抑制HBV的作用是否與此相關,為此我們首先在Huh7細胞內過表達TBK1,結果發(fā)現(xiàn)其并不能增強DAI對HBV的抑制作用。進而我們將DAI與IRF-3共轉細胞,檢測IRF-3的活化程度,結果顯示IRF-3的入核和磷酸化都無明顯變化,我們將DAI與IRF-3的永久失活體質粒(失去N端的DNA結合區(qū)域的截短體(IRF-3△N))共轉細胞,發(fā)現(xiàn)IRF-3△N并不影響DAI對HBV的抑制作用,由此提示Huh7細胞內DAI不能激活IRF-3,DAI抑制HBV復制不依賴于TBK1/IRF-3介導的干擾素產生。 NF-κB是固有抗病毒免疫中的一個重要的轉錄因子,研究發(fā)現(xiàn)B-DNA誘導的NF-κB的DNA結合活性中DAI有重要的作用,本研究的實驗也證明DAI能以劑量依賴的方式激活NF-kB轉錄啟動活性。我們進一步應用NF-κB的超抑制劑I kBα-SR(superrepressor)發(fā)現(xiàn)可以回復DAI對HBV的抑制作用,這提示DAI抑制HBV的活性可能與其激活NF-KB的相關。 NF-κB活化后可以啟動包括干擾素在內的抗病毒細胞因子的轉錄,為探索DAI抑制HBV是否依賴于其對干擾素的誘生,我們首先在RNA和蛋白水平檢測DAI在Huh7細胞內能否誘導干擾素產生,結果發(fā)現(xiàn)DAI不能誘導干擾素的產生。為了進一步排除干擾素或者其他分泌到細胞外的細胞因子是DAI發(fā)揮抑制HBV的效應因子,我們做了上清置換試驗,將轉染了DAI的細胞上清加入到HBV復制的細胞中,結果并未發(fā)現(xiàn)DAI表達的細胞上清具有抑制HBV的復制的效應。 綜上所述,本文的結果證明DAI (ZBP1/DLM-1)是一種具有抗乙型肝炎病毒活性的干擾素誘生蛋白,過表達DAI可以下調HBV RNA,復制中間體DNA以及e、s抗原水平,這種下調可能與激活NF-κB的活性相關但不依賴于它對干擾素產生的誘導。以上發(fā)現(xiàn)豐富了對干擾素抗病毒作用機制的認識,為HBV感染的治療提供了新的思路和實驗基礎。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

0500100020003000400050006000功 seofIFN一aOU八刊)圖1· 1IFN一a可以上調DAI的RNA水平A.l「N一a處理Huh7細胞誘導OAI的轉錄水平升高Huh7細胞鋪板后16小時，用不同劑量的(0一6000U)的IF閃一a處理6個小時，Real一time戶C尺檢測細胞內OAI蛋白的尺NA水平。B.l「N。a處理有HBV復制的Huh7細胞誘導OAI的轉錄水平升高

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HA一DAI一Aeti互1圖3一 1.Real一 timePCR檢測DAI下調 HBVRNA水平A.Real一 timepCR檢測DAI下調 HBvRNA水平Huh7種植于12孔板，分4組，每組3副孔，12小時后每孔轉入 HBVI.3質粒0.2“g分別轉入0， 0.1pg，0.2;g，0.4pg的HA一DA.，不足量用空載補齊，每孔轉入 0.109的GFp作為轉染效率的參照。轉染后48小時裂細胞抽RNA
【參考文獻】

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1 Michael Kann;André Schmitz;Birgit Rabe;;Intracellular transport of hepatitis B virus[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

本文編號：2857631