雙歧桿菌是人體腸道中一種最重要的生理菌，對(duì)人體健康具有重要意義，已有大量有關(guān)雙歧桿菌抗腸道致病菌感染的報(bào)道。但雙歧桿菌活菌制劑在應(yīng)用于腸屏障功能障礙時(shí)也存在幾個(gè)問題：一是該活菌制劑在制造與保存方面尚有一定難度，二是活菌在腸屏障功能障礙病人腸道可能由于局部氣體和生長(zhǎng)底物的不足而難以足量繁殖。近年來，有國(guó)外學(xué)者報(bào)道：雙歧桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附可能有蛋白質(zhì)樣物質(zhì)參與，還有人從長(zhǎng)雙歧桿菌SBT2928培養(yǎng)上清中分離出一種蛋白質(zhì)成分，該種蛋白質(zhì)成分能抑制ETEC對(duì)其糖脂結(jié)合受體(GA1)的粘附，同時(shí)也能抑制其對(duì)腸上皮細(xì)胞HCT-8的粘附且呈劑量依賴效應(yīng)。由此提示雙歧桿菌可能存在分泌型粘附素成分。1999年，我室也從青春型雙歧桿菌1027耗盡培養(yǎng)上清液中提取純化出一種分子量為16KDa的蛋白質(zhì)，但未對(duì)其生理作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究的目的是：(1)通過化學(xué)層析等方法較大量地制備雙歧桿菌分泌型粘附素成分，體外觀察其對(duì)雙歧桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的介導(dǎo)作用；(2)評(píng)價(jià)其體外對(duì)ETEC、EPEC和艱難梭菌等致病菌粘附腸上皮細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；(3)評(píng)價(jià)其對(duì)腸上皮細(xì)胞系增殖／凋亡活性及上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響；(4)探討其對(duì)上皮細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB活性的影響，以評(píng)價(jià)其生物調(diào)節(jié)活性，并從分子水平初步探討其作用機(jī)理。 一、雙歧桿菌分泌型粘附素的分離純化及其對(duì)雙歧桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的介導(dǎo)作用 采用硫酸銨沉淀、Superdex 75凝膠過濾和Q-Sepharose FF離子交換色譜法對(duì)雙歧桿菌分泌型粘附素進(jìn)行分離純化，并經(jīng) SDS一PAGE鑒定，獲得一分子量大約為1 6Kda的蛋白質(zhì);為研究其對(duì)雙 歧桿菌粘附腸上皮細(xì)胞的介導(dǎo)作用，采用粘附試驗(yàn)進(jìn)行觀察。結(jié)果表明: 粘附素介導(dǎo)的雙歧桿菌對(duì)體外培養(yǎng)腸上皮細(xì)胞的粘附具有濃度和時(shí)間依 賴性，當(dāng)其濃度為30 p g/ml、時(shí)間為3小時(shí)時(shí)，粘附達(dá)到飽和狀態(tài);粘 附素懸浮的雙歧桿菌對(duì)Lovo細(xì)胞的粘附能力與耗盡培養(yǎng)上清懸浮的雙 歧桿菌的粘附能力無顯著性差別(分別為18.28士6.55和19.90土6.07， P0.05)，但明顯強(qiáng)于用PBS懸浮的雙歧桿菌(8.50士3.30，尸0.01)，細(xì) 菌呈線性粘附于細(xì)胞周圍。上述結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功分離純化了雙歧 桿菌分泌型粘附素，其分子量大約為16KDa;粘附素能特異性地介導(dǎo)雙 歧桿菌粘附于腸上皮細(xì)胞周圍，并且具有濃度和時(shí)間依賴性。 二、雙歧桿菌分泌型粘附素對(duì)致病菌粘附腸上皮細(xì)胞的竟?fàn)幰种谱?用Lovo細(xì)胞預(yù)先與不同濃度的雙歧桿菌分泌型粘附素孵育30分鐘后， 再與ETEC、EPEC和艱難梭菌進(jìn)行粘附試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除粘附素濃度 為1林留ml和5林g/m1時(shí)不能明顯抑制病原菌對(duì)Lov。細(xì)胞的粘附外， 10林留ml，20林g/ml，30林g/m1濃度組均能明顯抑制病原菌對(duì)Lovo細(xì)胞的 粘附，且隨濃度的逐漸增加，這種抑制作用也逐漸增強(qiáng)。粘附素濃度為 30“留ml時(shí)，對(duì)ETEC、EPEC或艱難梭菌粘附Lovo細(xì)胞的抑制作用與 雙歧桿菌+ETEC、雙歧桿菌+EPEC或雙歧桿菌+艱難梭菌組相比無顯著 差異(P0.05)。ETEC和EPEC呈線狀粘附于細(xì)胞周圍，而艱難梭菌呈 簇狀粘附于細(xì)胞周圍。粘附素濃度為1“g/ml和5林g/m1時(shí)，ETEC、EPEC 和艱難梭菌粘附腸上皮細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與無粘附素時(shí)相比無顯著差 別;而10林留ml，20林g/m1，30林留ml濃度組的平均熒光強(qiáng)度均顯著低于 ETEC、EPEC或艱難梭菌單獨(dú)作用組(尸0.01)，且隨濃度的逐漸增加， 熒光強(qiáng)度也逐漸減弱。其中30林g/ml濃度組的平均熒光強(qiáng)度與雙歧桿菌 +ETEC、EPEC或艱難梭菌組相比無顯著差別(PO.05)。上述結(jié)果提示， 在體外實(shí)驗(yàn)中，青春型雙歧桿菌1027的純化粘附素能有效地抑制ETEC、 EPEC和艱難梭菌對(duì)腸上皮Lovo細(xì)胞的粘附且呈劑量依賴效應(yīng)。 三、雙歧桿菌分泌型粘附素對(duì)脂多糖和H202調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞增殖 和凋亡的影響采用3H一TdR摻入法測(cè)定細(xì)胞增殖的結(jié)果表明，100雌/L LPS能顯著促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，而雙歧桿菌分泌型粘附素則能抑制 LPS對(duì)腸上皮細(xì)胞的促增殖作用，且隨粘附素濃度的升高，抑制作用有 4 逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)(P0.01一0.05)。而200林mol幾玩O:對(duì)腸上皮細(xì)胞有明 顯的抑制增殖作用(PO.01)，雙歧桿菌分泌型粘附素可對(duì)抗玩02的這 種抑制增殖作用(尸0.01一0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，對(duì)照 組細(xì)胞凋亡率為(4.40士0.52)%，LPS處理組細(xì)胞凋亡率為(14.63士0.57) %，加入雙歧桿菌分泌型粘附素后，細(xì)胞凋亡率逐漸下降，隨著粘附素 濃度的逐漸升高，這種作用更為明顯(P0.01一0.05)。而HZo:處理組， 其細(xì)胞凋亡率達(dá)(23.28士0.68)%，雙歧桿菌分泌型粘附素處理后，細(xì) 胞凋亡率也逐漸下降，而且隨著粘附素濃度的逐漸升高，這種抑制作用 也更為明顯(p0 .01一0.05)。丫淀橙染色、電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化發(fā) 現(xiàn)，LPS和玩02處理組可見較多凋亡細(xì)胞，核濃縮，聚集于核周邊或裂 解成碎片;而先經(jīng)粘附素處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)則明顯減少。光鏡下觀察 見LPS或H20:處理組細(xì)胞變小、變圓，胞漿顆粒明顯增多，部分細(xì)胞 脫落漂浮于培養(yǎng)基中;細(xì)胞先經(jīng)粘附素處理后，變小、變圓，胞漿顆粒 增多的細(xì)胞較單獨(dú)LPS或HZ
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R574
【部分圖文】：

青春型雙歧桿菌1027菌株培養(yǎng)上清經(jīng)硫酸錢沉淀、SuPerdex75柱凝膠過濾、Q一SePharoseFF離子交換層析后，進(jìn)行SDs一PAGE分析，得到一單一條帶蛋白質(zhì)，分子量約為16KDa。(如圖1)。7KD43KDa31KDaZOKDa14KDa16KD8圖1雙歧桿菌粘附素SDS一隊(duì)GE分析1:低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn);2:粘附素Fig.1Al1alysisofbifidobaeteriumseeretionadhesinbySDS一衛(wèi)AGE1:Proteinmarker;2:adhesin

耗盡培養(yǎng)上清懸浮的雙歧桿菌的粘附能力無顯著性差別(尸>0.05)，但明顯強(qiáng)于用PBS懸浮的雙歧桿菌(P<0.ol)，細(xì)菌呈線性粘附于細(xì)胞周圍(見圖4、5)。表1不同處理因素對(duì)雙歧桿菌粘附助vo細(xì)胞的影響1知b.1Effeetsofdifl七rentPretreatmentsonadhesionofstrain1027ofbifidobaeteriatoLovoCellsGrouPbaeteria/cell(x士s)adhesin18.28士6.55eulturesuPematants19.90士6.07(‘)PBS8.50士3.30‘2)(1)P)0.05vsadhesin;(2)尸<0.01vsadhesin圖4純化粘附素介導(dǎo)的雙歧桿菌對(duì)劫vo細(xì)胞的粘附(Gram染色X1000)Fig.4Adhesionofstrain1027ofbifidobacteriato助voeellsmediatedbyPurifiedadhesin(

圖5PBS介導(dǎo)的雙歧桿菌對(duì)Lovo細(xì)胞的粘附(Gram染色X1000)Adhesionofstrain1027ofBifidobaeteriato助voeellsmediateramstainX1000)討論附是細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的第一步。雙歧桿菌作為人益菌，其在腸道中的粘附及定植，對(duì)維護(hù)腸粘膜屏障的完意義。Matsumoto等[l7]證實(shí)雙歧桿菌LKM512能抑制包括在內(nèi)的多種腸道致病菌對(duì)腸粘膜的粘附。但有關(guān)介導(dǎo)雙歧質(zhì)，目前尚不清楚。既往一般認(rèn)為，脂磷壁酸是介導(dǎo)雙歧質(zhì)。然而，1997年，日本學(xué)者Fujiwara等發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的明顯地抑制EPEC的粘附，且于1999年從中分離出一種分a的蛋白質(zhì)，此種物質(zhì)能抑制EPEC對(duì)gliotetraosyzeeramide)的粘附。隨后，他們又證實(shí)從雙歧桿中分離出的該種蛋白質(zhì)物質(zhì)成分能抑制ETEC對(duì)其糖脂結(jié)AI的粘附，同時(shí)也能抑制其對(duì)腸上皮細(xì)胞HCT-8的粘附且，‘2，‘。，，‘9
【參考文獻(xiàn)】

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