目的:腸道微生態(tài)與宿主之間和諧共存,互惠互利,宿主為微生態(tài)提供賴以生存的環(huán)境和營養(yǎng),微生態(tài)為人類腸道代謝及免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟提供必要的營養(yǎng)素,腸道菌群對維持正常消化吸收、能量代謝和免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。而失衡的腸道微生態(tài),將導(dǎo)致腸道免疫及能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡,導(dǎo)致腸道免疫紊亂、易于感染,及與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。再生基因Ⅲ(Reg Ⅲ)蛋白,為腸道表達的一類具有抵御腸道內(nèi)細菌及病原微生物能力的抗菌肽,發(fā)揮對宿主的固有防御作用,在腸黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1),由G蛋白偶聯(lián)受體43(GPR43)介導(dǎo)腸道L細胞合成,具有重要的能量代謝調(diào)節(jié)作用。本研究擬構(gòu)建腸道菌群平衡與腸道菌群失衡模型,通過對腸黏膜免疫及腸道激素關(guān)鍵靶點的檢測,探討平衡與失衡狀態(tài)的腸道菌群對宿主腸黏膜免疫及腸道激素的影響及潛在機制。第一部分腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)腸道Reg Ⅲ表達及相關(guān)免疫機制研究方法:以無菌小鼠為研究對象,通過糞菌移植構(gòu)建腸道微生態(tài)平衡模型,以同齡無菌小鼠為對照;以SPF小鼠為研究對象,應(yīng)用萬古霉素干預(yù)構(gòu)建腸道微生態(tài)失衡模型,以正常SPF小鼠為對照。通過免疫組化染色和Real-time RT-PCR的方法,檢測腸道組織抗菌肽Reg Ⅲ的表達及相關(guān)細胞因子表達譜。體外實驗,以人類結(jié)腸腺癌Caco-2細胞系為研究對象,驗證相關(guān)細胞因子誘導(dǎo)抗菌肽Reg Ⅲ表達的作用。結(jié)果:1、接受腸道菌群移植4周后的無菌小鼠,與正常無菌小鼠相比,其腸道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA及蛋白表達水平上調(diào);接受萬古霉素干預(yù)1周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其腸道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA及蛋白表達水平下調(diào)。2、接受腸道菌群移植4周后的無菌小鼠,與正常無菌小鼠相比,其腸道Th17相關(guān)細胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表達水平上調(diào);接受萬古霉素干預(yù)1周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其腸道Th17相關(guān)細胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表達水平下調(diào)。3、腸道抗菌肽Reg Ⅲgm RNA表達水平與腸道Th17相關(guān)細胞因子(IL-6,IL-17A,IL-22)m RNA表達水平呈正相關(guān)。4、腸道Th17效應(yīng)細胞因子(IL-17A和IL-22)可能通過上調(diào)細胞內(nèi)STAT3通路,參與誘導(dǎo)人類Caco-2細胞系抗菌肽Reg Ⅲ的表達。第二部分腸道微生態(tài)失衡調(diào)節(jié)腸道GLP-1表達及相關(guān)功能研究方法:以SPF小鼠為研究對象,應(yīng)用不同濃度萬古霉素飲水干預(yù)構(gòu)建腸道微生態(tài)失衡動物模型,以正常SPF小鼠為對照;以無菌小鼠為研究對象,將經(jīng)萬古霉素誘導(dǎo)的失衡的腸道糞菌,通過糞菌移植技術(shù)移植給無菌小鼠,構(gòu)建腸道菌群失衡移植模型,以接受正常糞菌移植的無菌小鼠為對照。檢測實驗小鼠體重、攝食量、血糖及全消化道動力。通過免疫組化染色、Real-time RT-PCR、ELISA等方法,檢測腸道組織GLP-1、GPR43的表達,及血清GLP-1的表達水平。結(jié)果:1、接受萬古霉素(0.2mg/ml)飲水干預(yù)5周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其攝食量、體重增長率相對較高,其GITT相對較長;接受失衡菌群移植5周后的無菌小鼠,與接受正常菌群移植5周后的無菌小鼠相比,其攝食量、體重增長率均相對較高;其GITT相對較長。2、接受萬古霉素(0.2mg/ml)飲水干預(yù)5周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其空腹血糖水平、血清GLP-1水平相對較高;接受失衡菌群移植5周的無菌小鼠,與接受正常菌群移植5周的無菌小鼠相比,其空腹血糖水平、血清GLP-1水平相對較高。3、接受萬古霉素(0.2mg/ml)飲水干預(yù)5周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其腸道組織Proglucagon m RNA、GLP-1蛋白陽性細胞水平相對上調(diào)表達;接受失衡菌群移植5周的無菌小鼠,與接受正常菌群移植5周的無菌小鼠相比,其腸道組織Proglucagon m RNA、GLP-1蛋白陽性細胞水平相對上調(diào)表達。4、接受萬古霉素(0.2mg/ml)飲水干預(yù)5周后的SPF小鼠,與正常SPF小鼠相比,其腸道組織GPR43受體m RNA和蛋白水平相對上調(diào)表達;接受失衡菌群移植5周的無菌小鼠,與接受正常菌群移植5周的無菌小鼠相比,其腸道組織GPR43受體m RNA和蛋白水平相對上調(diào)表達。結(jié)論:1、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)腸道抗菌肽Reg Ⅲ的表達。腸道微生態(tài)可能通過調(diào)節(jié)腸道Th17細胞效應(yīng)細胞因子(IL-17、IL-22)介導(dǎo)腸道上皮細胞Reg Ⅲ的表達。2、萬古霉素誘導(dǎo)腸道菌群失衡調(diào)節(jié)腸道GLP-1的表達。失衡的腸道菌群,可能通過GPR43/GLP-1通路,對宿主消化道動力及能量代謝產(chǎn)生影響。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R57
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)腸道 Reg III 表達及相關(guān)免疫機制研究1.2 結(jié)果1.2.1 腸道菌群移植對無菌小鼠腸道組織病理學(xué)的影響接受腸道菌群移植 4 周后的無菌小鼠，以未接受菌群移植的同齡無菌小鼠為對照，各實驗組腸道組織進行 HE 染色，觀察病理學(xué)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未接受菌群移植的無菌小鼠，小腸壁較薄，小腸絨毛發(fā)育不成熟，排列稀疏，未見病理異常，小腸腺體稀疏，腸黏膜淋巴樣細胞貧乏；接受腸道菌群移植 4 周后的無菌小鼠，小腸腸壁明顯增厚，小腸粘膜發(fā)育良好，小腸絨毛豐厚，排列緊密，未見病理異常，小腸腺體豐富，腺窩深度增加，黏膜淋巴樣細胞豐富（圖 1.1）。同樣的，未接受菌群移植的無菌小鼠，結(jié)腸壁較薄，排列稀疏，未見病理異常，結(jié)腸腺體稀疏，腸黏膜淋巴樣細胞貧乏；接受腸道菌群移植 4 周后的無菌小鼠，結(jié)腸壁明顯增厚，結(jié)腸粘膜發(fā)育良好，未見病理異常，結(jié)腸腺體豐富，腺窩深度增加，腸黏膜淋巴樣細胞豐富（圖 1.1）。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)腸道 Reg III 表達及相關(guān)免疫機制研究平結(jié)果一致�？梢姡瑹o菌小鼠腸道抗菌肽 Reg III 低水平表達，腸道菌群移植 4周，可重構(gòu)無菌小鼠腸道抗菌肽 Reg III 的表達，也就是說腸道共生菌在維持腸道抗菌肽 Reg III 的表達中發(fā)揮重要作用。

圖 1.4 T 細胞分化相關(guān)細胞因子譜系圖為檢測腸道菌群移植對無菌小鼠腸道適應(yīng)性免疫及 T 細胞分化的影響和改變，我接下來應(yīng)用 Real-time RT-PCR 的方法對實驗小鼠腸道組織細胞因子表達譜的 mRNA 水平進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸和結(jié)腸組織 IL-12 mRNA 表達水平顯著低于未接受菌群移植的無菌小鼠（圖 1.5A），差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸和結(jié)腸組織 INF- mRNA 表達水平與未接受菌群移植的無菌小鼠無明顯差異（圖 1.5 B）；接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸和結(jié)腸組織 IL-4 mRNA 表達水平與未接受菌群移植的無菌小鼠無明顯差異（圖 1.5 C）； 接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸（P<0.01）和結(jié)腸（P<0.05）組織 IL-6 mRNA 表達水平顯著高于未接受菌群移植的無菌小鼠，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（圖 1.5 D）；同樣的，接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸和結(jié)腸組織 IL-17A mRNA 表達水平均顯著高于未接受菌群移植的無菌小鼠（圖 1.5 E），差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；同樣的，接受菌群移植 4 周后的無菌小鼠小腸和結(jié)腸組織 IL-22 mRNA 表達水平均顯著高于未接受菌群移植
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本文編號：2856396