目的:自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis,AIH)是一種慢性炎癥性肝病,其特點(diǎn)是循環(huán)中自身抗體陽性和血清免疫球蛋白水平升高。研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性疾病中濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular helper T cells,Tfh細(xì)胞)和濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Follicular regulatory T cells,Tfr細(xì)胞)的比例失衡,導(dǎo)致大量的自身反應(yīng)性B細(xì)胞的分化及致病性自身抗體的產(chǎn)生。本研究通過檢測AIH患者及健康對(duì)照組外周血中Tfh、Tfr細(xì)胞的比例和外周血中IL-21的表達(dá),并通過分析Tfh細(xì)胞比例改變對(duì)AIH患者脾臟生發(fā)中心反應(yīng)和循環(huán)中漿細(xì)胞及記憶B細(xì)胞的影響,探討Tfh和Tfr細(xì)胞的比例失衡在AIH發(fā)病中的潛在作用及其參與AIH發(fā)病中的具體機(jī)制。方法:1、收集于2018年1月-2018年9月在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化科住院部就診的AIH患者20例,所有受試者均未接受過藥物治療,并排除其他自身免疫性疾病和惡性腫瘤病史。健康對(duì)照組為15名來自體檢中心,性別、年齡與AIH組相匹配的,既往無自身免疫性疾病或惡性腫瘤病史的查體者。收集各組受試者的靜脈血,提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood monocular cell,PBMC)后,用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測受試者外周血中Tfh細(xì)胞、Tfr細(xì)胞的比例并分析Tfh細(xì)胞與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。RT-PCR分析AIH患者和健康對(duì)照組外周血中IL-21的表達(dá)情況。2、收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科在2008年至2018年間納入的自身免疫性肝炎肝硬化行脾切除術(shù)的患者6例和對(duì)照慢性肝病患者2例、外傷脾破裂患者2例,應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法和免疫熒光法觀察各組患者生發(fā)中心的形態(tài)和CD4、CXCR5等蛋白的表達(dá)情況,并分析AIH患者脾切除術(shù)前后臨床指標(biāo)的改變。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測20名AIH患者和15名健康對(duì)照外周血中漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞的比例,分析AIH患者外周血中漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞與Tfh細(xì)胞及臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果:1.AIH患者循環(huán)中CD4~+CXCR5~+T細(xì)胞的比例為24.65±7.89,相比于健康對(duì)照組的(16.75±6.01),比例顯著增加(P0.05)。其中,AIH患者外周血中CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh細(xì)胞的比例為3.26±0.85,比健康對(duì)照外周血中的(1.01±0.32)顯著增加(p0.001);同時(shí),AIH患者CD4~+CXCR5~+FOXP3~+Tfr細(xì)胞(0.87±0.46比例較健康對(duì)照組(1.26±0.44)減少(P0.05)。AIH患者外周血中CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh細(xì)胞與臨床指標(biāo)例相關(guān)性分析的結(jié)果表明,AIH患者的CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh細(xì)胞的數(shù)量與患者血清IgG呈正相關(guān)(r=0.6020,p=0.0174),與ALT、AST、ALP、GGT及IgM無明顯相關(guān)。RT-PCR分別檢測7名AIH患者和5名健康對(duì)照組外周PBMC中Tfh細(xì)胞的主要細(xì)胞因子IL-21的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,相比于健康查體者,AIH患者外周血中IL-21的表達(dá)水平增加(3.49±1.5 vs 0.98±0.39,P0.01)。2.脾臟組織HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),AIH患者脾臟較乙肝肝硬化組和外傷脾破裂組生發(fā)中心體積增大,數(shù)目增多,形態(tài)不規(guī)則;同時(shí),與外傷脾破裂患者相比,AIH肝硬化患者脾臟組織CD4~+CXCR5~+T細(xì)胞比例明顯增加。AIH患者行脾切除后,血清IgG水平較術(shù)前明顯下降,而ALT,AST,GGT,IgM等指標(biāo)無明顯差異。3.漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞的流式結(jié)果示,AIH患者外周血中CD19~+CD27~+CD38~(++)漿細(xì)胞的水平(3.08±1.2)顯著高于健康對(duì)照組(1.39±0.61,P0.01);AIH患者外周血中的CD19~+CD28~+CD38~(-/+)記憶B細(xì)胞的比例為(26.91±4.85),相比健康對(duì)照組(2.34±5.09)顯著增加(P0.001)。將AIH患者外周血中漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞的數(shù)目與CD4~+CXCR5~+PD-1~+Tfh細(xì)胞的比例進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)AIH患者外周血中的漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞均與Tfh細(xì)胞成正相關(guān)。臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,AIH患者外周血中的CD19~+CD27~+CD38~(++)漿細(xì)胞的數(shù)量與患者血清IgG(r=0.6393,p=0.0107)和IgM(r=0.5822,p=0.0228)呈正相關(guān),而與ALT、AST、ALP和GGT無明顯相關(guān)。結(jié)論:Tfh和Tfr細(xì)胞比例失衡通過導(dǎo)致脾臟生發(fā)中心反應(yīng)的異常擴(kuò)增,及促進(jìn)漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞的過度分化參與AIH的發(fā)病。深入探索Tfh細(xì)胞和Tfr比例失衡的原因和關(guān)鍵靶點(diǎn),可能為未來AIH治療方法的研究提供新的方向。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575.1
【部分圖文】：

圖 1. B 細(xì)胞對(duì) T 依賴抗原的反應(yīng)注：1.原始 CD4+T 細(xì)胞由 T 細(xì)胞區(qū)呈同源抗原的樹突狀細(xì)胞激活，短暫地表 CXCR5 并遷移到 T-B 邊界；2.活化的 B 細(xì)胞遷移到 B 細(xì)胞濾泡或 T 細(xì)胞區(qū)；.部分活化的 CD4+T 細(xì)胞可以獲得 Tfh 細(xì)胞系的特征，穩(wěn)定表達(dá) CXCR5；這些fh 細(xì)胞遷移到 B 細(xì)胞濾泡；4. B 細(xì)胞濾泡中活化的 B 細(xì)胞被濾泡樹突狀細(xì)胞 Tfh 細(xì)胞進(jìn)一步刺激；5.生發(fā)中心反應(yīng)誘導(dǎo)同型交換親和成熟 B 細(xì)胞向記憶 B胞或長壽漿細(xì)胞分化）綜上所述， Tfh 和 Tfr 兩種細(xì)胞可以通過調(diào)控 GC 形成、高親和力自身抗體產(chǎn)生及體液免疫的程度參與自身免疫性疾病的發(fā)生。研究者已在 RA、SLE 等種常見的自身免疫性疾病中發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的比例失衡，并且認(rèn)為 Tfh 細(xì)胞和fr 細(xì)胞比例失調(diào)后進(jìn)一步引起的過度的生發(fā)中心反應(yīng)導(dǎo)致了體液免疫系統(tǒng)的過活化和自身抗體的產(chǎn)生。然而在 AIH 中無論是 Tfh 和 Tfr 細(xì)胞還是漿細(xì)胞和憶 B 細(xì)胞的研究均十分少見，因此本研究希望通過初步探索 AIH 患者外周血 Tfh 和 Tfr 細(xì)胞的表達(dá)情況，并對(duì) AIH 患者脾臟中生發(fā)中心的反應(yīng)和外周血細(xì)胞記憶 B 細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行檢測，探索它們之間的相關(guān)性以及它們?cè)?AIH 發(fā)

計(jì)學(xué)方法據(jù)分析使用 IBM 公司的 SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資標(biāo)準(zhǔn)差（ x±s）表示，使用 t 檢驗(yàn)分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料范圍）表示，使用秩和檢驗(yàn)分析。相關(guān)性分析使用 Spearman 相關(guān)側(cè) P<0.05 為顯著相關(guān)。果用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組受試者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh征。流式檢測設(shè)門策略如圖 2 所示，根據(jù)前向角散射（FSC）和側(cè)C）將 PBMC 中的淋巴細(xì)胞設(shè)為 1 門（圖 2A）；將淋巴細(xì)胞中 C為 2 門（圖 2B）；根據(jù) BB515-CXCR5 熒光分析 AIH 組及健康對(duì)XCR5+（圖 2C）；根據(jù) APC-CD279 和 PE-Cyanine7-FOXP3 熒光 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 細(xì)胞（圖 2D）和 CD4+CXCR5+FOXP3+TfD4+的表達(dá)情況（圖 2E）；

圖 3.CD4+CXCR5+T 細(xì)胞在 AIH 組和健康對(duì)照組中的表達(dá)1.2.2 AIH 患者外周血 CD4+CXCR5+PD-1+T 細(xì)胞的比例特征進(jìn)一步分析 15 例 AIH 患者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AIH 患者外周血中 CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 細(xì)胞比例為 3.26±0.85，相比于健康對(duì)照外周血中的 1.01±0.32，比例顯著增加（p<0.001）。圖 4. CD4+CXCR5+PD-1+Tfh 在 AIH 組和健康對(duì)照組循環(huán)中的表達(dá)1.2.3 AIH 患者外周血 Tfr 細(xì)胞的比例特征同 時(shí) ， 我 們 檢 測 了 AIH 患 者 循 環(huán) 中 的 對(duì) Tfh 細(xì) 胞 有 抑 制 功 能 的
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