目的:探討血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)對同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)移植后在纖維化大鼠肝內(nèi)定植及治療肝纖維療效的影響,為BMSCs臨床應用提供實驗依據(jù)。方法:1.全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs,移植前用CM-Dil體外標記BMSCs,免疫熒光法和流式細胞技術鑒定。2.大鼠按0.3ml/100g,每周2次,腹腔注射40%CCl4建模,成模大鼠隨機分為對照組(同期假手術+等量注射生理鹽水4次,1周1次,n=6)、VEGF組(尾靜脈注射Ad VEGF溶液4次,1周1次+門靜脈注射生理鹽水1次,n=6)、BMSCs組(門靜脈移植BMSCs懸液1次+尾靜脈注射生理鹽水4次,1周1次,n=6)、聯(lián)合組(門靜脈移植BMSCs懸液1次+尾靜脈注射Ad VEGF溶液4次,n=6),12周后各組隨機取3只用伊文思藍法檢測肝血竇血管通透性,剩余各組大鼠處死取肝臟標本進行HE、Masson、天狼星紅染色,免疫熒光檢測α-SMA、CollagenⅢ,WB檢測TGF-β、α-SMA、ColleganⅢ,RT-q PCR檢測Col3α1、IL-6、Vimentin、Twist1、Snail、Slug、E-Cadherin、Occludin反應纖維化程度改變,免疫熒光、WB、RT-q PCR檢測肝臟中VEGF和Vcam-1的表達變化,免疫熒光檢測經(jīng)CM-Dil標記的BMSCs肝內(nèi)定植情況,免疫熒光檢測Ki67、PCNA,WB檢測CYP3A1、ALB,RT-q PCR檢測ALB、G6Pase。結(jié)果:四組大鼠肝纖維化相關檢測結(jié)果均提示,與對照組相比,聯(lián)合組纖維化改善情況最明顯,VEGF組無明顯改善,BMSCs組纖維化稍有好轉(zhuǎn)。伊文思藍結(jié)果提示VEGF組和聯(lián)合組肝內(nèi)伊文思藍殘留量最高。四組大鼠VEGF和Vcam-1表達量:免疫熒光切片顯示VEGF組、聯(lián)合組的VEGF表達量增加;VEGF組與聯(lián)合組之間變化不明顯,WB結(jié)果與免疫熒光相似。RT-q PCR的結(jié)果表明,與對照組相比,VEGF組、聯(lián)合組VEGF基因的表達量增加,(P0.05);不同組間VCAM-1表達量的差異變化與VEGF相似,VEGF組、聯(lián)合組對比對照組,Vcam-1表達量增加(P0.05)。熒光檢測經(jīng)CM-Dil標記的BMSCs在肝內(nèi)定植情況:BMSCs組定植數(shù)量較少,主要分布于肝內(nèi)匯管區(qū)及纖維隔鄰近區(qū)域,聯(lián)合組定植數(shù)量較多,在肝實質(zhì)內(nèi)分布相對均勻。RT-q PCR檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關指標,提示聯(lián)合組誘導轉(zhuǎn)化相關因子表達下降,抑制轉(zhuǎn)化相關因子表達升高。免疫熒光顯示Ki67和PCNA在BMSCs組和聯(lián)合組中陽性率較對照組增高;聯(lián)合組中陽性率也比BMSCs組高。WB檢測CYP3A1、ALB,BMSCs組、聯(lián)合組表達量增加,VEGF組未見明顯變化;聯(lián)合組表達量較BMSCs組增高較多。RT-q PCR檢測ALB、G6pase:與對照組相比,BMSCs組及聯(lián)合組表達增加,(P0.05),VEGF組、對照組兩組間對比增高較不明顯;聯(lián)合組與BMSCs組相比表達增加,(P=0.063)。結(jié)論:1.VEGF可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞在肝纖維化大鼠肝內(nèi)定植,其機制可能與VEGF可以增加肝血竇內(nèi)皮通透性及提高內(nèi)皮細胞Vcam-1的表達有關;2.VEGF可以提高骨髓間充質(zhì)干細胞治療肝纖維化大鼠的療效,提高肝臟再生水平,改善肝功能,其機制可能與VEGF可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞在肝纖維化大鼠肝內(nèi)定植有關。
【學位單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 袁3 結(jié)果3.1 BMSCs 的形態(tài)學及鑒定3.1.1 BMSCs 形態(tài)學觀察倒置相差光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離出的原代骨髓間充質(zhì)干細胞在接后 24h-48h 后可貼壁生長（圖 1-A），隨著傳代次數(shù)增加，到第三代時，細胞排規(guī)則，成規(guī)律性漩渦狀緊密排列，形態(tài)多呈長紡錘形或長梭形。（圖 1-B）

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 袁3 結(jié)果3.1 BMSCs 的形態(tài)學及鑒定3.1.1 BMSCs 形態(tài)學觀察倒置相差光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離出的原代骨髓間充質(zhì)干細胞在接后 24h-48h 后可貼壁生長（圖 1-A），隨著傳代次數(shù)增加，到第三代時，細胞排規(guī)則，成規(guī)律性漩渦狀緊密排列，形態(tài)多呈長紡錘形或長梭形。（圖 1-B）

學位論文 纖維化模型鑒定觀察大鼠肝臟病理切片結(jié)構(gòu)，是否出現(xiàn)了提示肝臟肝纖維。結(jié)果顯示肝細胞出現(xiàn)脂肪變性，伴有大量炎性細胞浸潤見正常肝小葉結(jié)構(gòu)，纖維組織增生，纖維隔形成，證明大成功。（圖 3）
【參考文獻】

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1 Rosanna Dono;;Glypican 4 down-regulation in pluripotent stem cells as a potential strategy to improve differentiation and to impair tumorigenicity of cell transplants[J];Neural Regeneration Research;2015年10期

2 Silvia Berardis;Prenali Dwisthi Sattwika;Mustapha Najimi;Etienne Marc Sokal;;Use of mesenchymal stem cells to treat liver fibrosis:Current situation and future prospects[J];World Journal of Gastroenterology;2015年03期

3 Hua-Lian Hang;Qiang Xia;;Role of BMSCs in liver regeneration and metastasis after hepatectomy[J];World Journal of Gastroenterology;2014年01期

4 ;Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2012年04期

5 袁新初,張?zhí)烀?肝血竇壁內(nèi)皮細胞的形態(tài)和機能[J];國外醫(yī)學(消化系疾病分冊);1990年03期

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1 施靜;胰島聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療糖尿病大鼠的研究[D];電子科技大學;2017年

2 周賢鋒;骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠肝硬化的實驗研究[D];川北醫(yī)學院;2016年

本文編號：2855687