[目的]γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10 (IP-10, CXCL10)是ELR的CXC趨化家族成員之一,也是CXCR3受體的一個配體,可以趨化NK細(xì)胞,活化的T細(xì)胞,DC細(xì)胞等。在HBV感染的病人外周血單個核細(xì)胞,肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,血小板中,IP-10的mRNA和蛋白質(zhì)水平都顯著增高。IP-10基因敲除的小鼠對穩(wěn)定性嗜神經(jīng)小鼠肝炎病毒的免疫反應(yīng)減弱,伴隨腦部CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞浸潤減少和炎性因子釋放減少。因此,在HBV感染中,IP-10的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)及其免疫效應(yīng)是一非常重要的事件。但是,誘導(dǎo)IP-10表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制及其意義還不是十分清楚。在此研究中首先檢測了不同病人肝組織中IP-10的表達(dá),進(jìn)一步通過細(xì)胞模型探索了HBx誘導(dǎo)趨化因子IP-10表達(dá)的分子機(jī)制及其白細(xì)胞趨化效應(yīng)。 [方法] 1.在HBV感染病人肝臟組織中IP-10表達(dá)的檢測 12例(8例男性,4例女性；年齡在32-65之間,平均年齡48±9)接受外科手術(shù)治療的慢性HBV感染肝癌患者,7例接受外科手術(shù)治療的非HBV感染肝癌患者和5例肝血管瘤患者肝臟正常組織分別從華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院和協(xié)和醫(yī)院收集,肝臟組織中IP-10mRNA和蛋白的表達(dá)分別采用real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測。 2.轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞IP-10表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2 (pBlue-HBV, pCMV-HBs, pCMV-HBc, pCMV-HBx,)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IP-10采用ELISA方法檢測。 3.IP-10啟動子熒光素酶報告基因活性檢測 一系列5’端截短突變的IP-10啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒和NF-κB突變的IP-10啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建,并與HBx真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。48h后檢測熒光素酶活性。 4.凝膠遷徙阻滯實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的細(xì)胞核抽提物與生物素標(biāo)記的NF-κB1探針共同孵育,加入或不加入未標(biāo)記的野生型NF-κB1探針或未標(biāo)記的突變型NF-κB1探針,隨后用6%聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE中電泳,電泳后轉(zhuǎn)膜,Image Station 4000R成像檢測膜上化學(xué)發(fā)光信號。 5.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后用1%甲醛交聯(lián),超聲打斷染色質(zhì),與anti-p65抗體,anti-p50抗體或同型對照IgG一起孵育共沉淀。從染色體-抗體復(fù)合物中分離出DNA用于PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳分析。 6.激光共聚焦顯微術(shù) 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞爬片用冷甲醇固定,1%牛血清白蛋白封閉,anti-p65一抗孵育。FITC標(biāo)記的二抗檢測信號,激光共聚焦顯微鏡觀察。 7.趨化實(shí)驗(yàn) 趨化實(shí)驗(yàn)采用5-μm孔徑的24孔Transwell板進(jìn)行。1×105外周血單個核細(xì)胞用200μl RPMI培養(yǎng)液懸浮加入到上室。1ml轉(zhuǎn)染了相應(yīng)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞上清液加入下室。Transwell板在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后,對趨化的細(xì)胞HE染色,計數(shù)。 [結(jié)果] 1.HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達(dá) 采用real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測HBV感染肝臟組織中IP-10mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果提示,HBV陽性的肝癌組織中IP-10的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于HBV陰性肝癌組織以及肝血管瘤的正常肝臟組織,這些數(shù)據(jù)表明,在HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達(dá)升高,可能在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥損傷中起著重要作用。 2. HepG2細(xì)胞中HBx蛋白誘導(dǎo)IP-10的表達(dá) 轉(zhuǎn)染了HBV全長表達(dá)質(zhì)粒(pBlue-HBV)后,HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IP-10蛋白水平顯著增高。為了檢測HBV不同蛋白分子對誘導(dǎo)IP-10的作用,分別轉(zhuǎn)染了編碼不同HBV蛋白分子的真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-HBs, pCMV-HBc, pCMV-HBx),結(jié)果表明HBx蛋白可以顯著增加IP-10的表達(dá)。IP-10啟動子熒光素酶活性分析結(jié)果提示IP-10的啟動子能被HBx蛋白呈劑量依賴性激活。 3.HBx誘導(dǎo)的IP-10表達(dá)上調(diào)是通過激活TRAF2/TAK1/NF-κB信號途徑 為了探討HBx誘導(dǎo)IP-10表達(dá)的機(jī)制,構(gòu)建了一系列5’端缺失的IP-10啟動子熒光素酶報告基因載體,并與HBx真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HBx共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。熒光素酶活性檢測結(jié)果提示在IP-10啟動子nt-190 to-96區(qū)域?qū)Bx激活I(lǐng)P-10啟動子起重要作用,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在這一區(qū)域有兩個NF-κB結(jié)合位點(diǎn)(NF-κB1和NF-κB2)。NF-κB結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí),IP-10啟動子的NF-κB1結(jié)合位點(diǎn)對HBx誘導(dǎo)IP-10表達(dá)起作用。加入NF-κB的抑制劑SN50后,可抑制HBx誘導(dǎo)的IP-10表達(dá)。同時,NF-κB亞單位p65和p50的增加能夠促進(jìn)IP-10的表達(dá)。 為了探討激活的NF-κB是否直接與IP-10啟動子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)對其調(diào)控,進(jìn)一步進(jìn)行了EMSA和CHIP實(shí)驗(yàn)。用生物素標(biāo)記的IP-10啟動子NF-κB1寡核苷酸探針檢測結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染了pCMV-HBx質(zhì)粒的細(xì)胞核抽提物中NF-κB蛋白與DNA的結(jié)合增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染了pCMV-HBx質(zhì)粒的細(xì)胞核抽提物,用anti-p50或anti-p65抗體進(jìn)行免疫沉淀,沉淀物分離出的DNA能夠擴(kuò)增出177bp的IP-10啟動子序列。以上結(jié)果顯示,NF-κB能夠與IP-10啟動子上的NF-κB1結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。 為了進(jìn)一步探討HBx激活NF-κB的機(jī)制,western blot、啟動子熒光素酶活性以及共聚焦顯微鏡術(shù)檢測結(jié)果提示,在轉(zhuǎn)染了HBx蛋白真核表達(dá)載體pCMV-HBx后,HepG2細(xì)胞中TAK1和IKKα的磷酸化水平增加。加入TAK1的抑制劑或轉(zhuǎn)染TAK1的siRNA阻斷TAK1的作用后,NF-κB和IP-10的啟動子活性均被抑制。TRAF家族成員TRAF2阻斷后也能阻礙NF-κB和IP-10的啟動子活性。同時,在TAK1和TRAF2阻斷后NF-κB亞單位p65的核轉(zhuǎn)位被抑制。上述結(jié)果顯示,HBx誘導(dǎo)的IP-10轉(zhuǎn)錄表達(dá)是通過激活TRAF2/TAK1/NF-κB信號通路而實(shí)現(xiàn)的。由此我們推測,HBx可能通過TLR信號傳導(dǎo),TAK1被激活,進(jìn)而激活I(lǐng)KK,最終激活NF-κB。 4.HBx誘導(dǎo)IP-10表達(dá)上調(diào)增加外周血單個核細(xì)胞的趨化性 趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相比轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染了HBx,NF-κB p50或NF-κBp65真核表達(dá)質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞上清液對外周血單個核細(xì)胞的趨化活性增加。加入抗IP-10的中和抗體后能減弱其對外周血單個核細(xì)胞的趨化。加入了NF-κB的抑制劑SN50后,能減弱轉(zhuǎn)染HBx的細(xì)胞上清誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞的趨化性。 [結(jié)論]本課題研究證明HBV陽性的肝癌組織中IP-10的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于HBV陰性肝癌組織以及肝血管瘤的正常肝臟組織,提示在HBV感染的肝臟組織中IP-10的表達(dá)可能在HBV誘導(dǎo)的肝臟炎癥損傷中起著重要作用。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染了編碼HBV不同蛋白基因的HepG2細(xì)胞模型,探討了HBV誘導(dǎo)IP-10表達(dá)的機(jī)制,研究證明病毒蛋白HBx可誘導(dǎo)炎性趨化因子IP-10表達(dá)增加,其機(jī)制為病毒蛋白HBx通過激活TRAF2/TAK1/NF-κB信號通路,從而導(dǎo)致IP-10啟動子的轉(zhuǎn)錄激活,IP-10的表達(dá)增加。由此推測,HBx誘導(dǎo)的IP-10等趨化因子的表達(dá)增加,趨化炎性細(xì)胞的浸潤可能在導(dǎo)致肝臟免疫損傷中起重要作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

為了證實(shí)在HBV感染的肝臟組織中IP一10的表達(dá)情況，本研究首先采用Real TimePCR和免疫組織化學(xué)方法分別檢測了臨床肝組織標(biāo)本中IP一 10mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，圖1一IA結(jié)果可見在HBV感染的肝癌組織中IP一10mRNA的表達(dá)水平顯著高于HBV陰性的肝癌組織以及HBV陰性的肝血管瘤患者正常肝臟組織的表達(dá)，三組患者肝組織IP一10蛋白表達(dá)的差異與mRNA的表達(dá)具有同樣的趨勢(圖1一IB)。提示炎性趨化因子IP一10在HBV感染的肝臟組織中表達(dá)升高，其高表達(dá)可能在HBV感染引起的肝臟炎癥損傷中起重要作用。嘛勻、屯夢索了一雙︸訊1價少.︸‘一.、尸.戶炸。.甘P《0.051:t::孟a’戶.夕不“·’二、:‘’獷f‘介:之_、·、·行、、.，會冷了季、‘產(chǎn)_氣心氣‘今價.方.一一，‘?戶f二、二.“飛、�！� 01401e012010co8咖co4栩似。 ad0000000一目口，.一VN比OE叮幾一口，一節(jié)一O比

細(xì)胞HepGZ中。轉(zhuǎn)染48h后，通過real一 timePeR和RT一PCR方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)各種相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子(IL一8，Ip一10，x一TAe，MeP一l，MIP一ra，MIP一lp，RANTES，CCLZO，IL一 18)mRNA的表達(dá)情況。圖1一2結(jié)果可見，未轉(zhuǎn)染基因的HePGZ細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCLS/RANTES水平較高(圖1一ZA)，HBx轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后可直接誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子或趨化因子的表達(dá)改變，在本實(shí)驗(yàn)所選取的幾種細(xì)胞因子中，CXCL10/IP一10表達(dá)上調(diào)最為明顯，其次是CCL20，有些趨化因子表達(dá)沒有明顯改變，部分細(xì)胞因子表達(dá)降低，如IL一18(圖1一ZB

一HBx誘導(dǎo)IP一10的表達(dá)Figurel一3.HBxProteininducesIP-10exPression·
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 于勤;鄭曉群;方唯一;;心肌特異性hVEGF_(165)真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];中國臨床醫(yī)學(xué);2006年02期

2 唐向輝;;體外制備RNA探針——一種極有希望的從質(zhì)粒DNA合成單鏈RNA新技術(shù)[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;1986年03期

3 逯好英;杜連英;馬賢凱;;表達(dá)載體pMM15的構(gòu)建[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;1983年06期

4 吳斌華;陳秋生;謝朝陽;朱少平;;Bcl-x基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2010年15期

5 馬紹輝,李琦涵;在結(jié)蛋白啟動子/增強(qiáng)子控制下的HBsAg表達(dá)質(zhì)粒DNA的有效接種[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2001年02期

6 茆達(dá)干,楊利國,曹少先;影響基因疫苗免疫效果的因素[J];中國免疫學(xué)雜志;2004年05期

7 胡新立,周迅蕾;Nodal基因5′末端側(cè)翼序列啟動子的分析[J];北京大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年02期

8 陳春華,曹英林,胡維誠,趙麗;通過定點(diǎn)誘變構(gòu)建帶有突變的載脂蛋白CⅡ啟動子的表達(dá)載體[J];癌變.畸變.突變;2003年01期

9 朱舟;陳華先;徐逸;張強(qiáng);陳晨;王偉;;NSE啟動子調(diào)控的pNSE-IRES2-EGFP-p27雙順反子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析[J];中國康復(fù);2007年06期

10 劉亞男;邵月婷;趙丹;汲坤;李曉潔;邵晨;王波;張爽;李馨;李揚(yáng);趙雪儉;;共表達(dá)p53及siRNA-VEGF質(zhì)粒的構(gòu)建及其在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué);2010年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 姜安麗;人同源盒基因NKX3.1啟動子的克隆及其調(diào)控區(qū)的鑒定[D];山東大學(xué);2005年

2 周玉;HBV感染病人肝臟組織中IP-10的表達(dá)與HBx誘導(dǎo)其表達(dá)的分子機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2010年

3 祝秉東;人β-防御素-1基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[D];四川大學(xué);2004年

4 劉南南;水稻種胚LOX3基因及啟動子的功能分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 羅先潤;Survivin啟動子馬區(qū)動CD/TK雙自殺基因?qū)ξ赴┑陌邢蛑委熥饔肹D];鄭州大學(xué);2012年

6 湯紹輝;人肝癌胰島素樣生長因子Ⅱ基因啟動子結(jié)構(gòu)與功能研究[D];暨南大學(xué);2004年

7 史巧娟;綠色熒光蛋白基因gfp在華癸中生根瘤菌與紫云英共生固氮體系研究中的應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

8 徐順霖;端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因在心肌中的表達(dá)及骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液對心肌的保護(hù)機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

9 邱亞峰;表達(dá)MDV gB CTL表位與雞HSP108融合蛋白基因的重組CVI988病毒的構(gòu)建及免疫保護(hù)試驗(yàn)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

10 梁小燕;抑癌基因LKB1調(diào)控細(xì)胞周期分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張磊;乙型肝炎病毒通過轉(zhuǎn)錄因子YY1在肝癌細(xì)胞中上調(diào)HLJ1基因的表達(dá)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

2 于文靜;亞麻韌皮部特異啟動子克隆與26份種質(zhì)DNA指紋圖譜構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

3 黃俊華;一種基于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的豬瘟病毒快速拯救系統(tǒng)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

4 崔磊;啟動子低甲基化導(dǎo)致NGALR在食管癌中過表達(dá)[D];汕頭大學(xué);2008年

5 吳濱;人�；o酶A：膽固醇�；D(zhuǎn)移酶-1基因P1啟動子的TNF-α效應(yīng)元件分析鑒定[D];華東師范大學(xué);2004年

6 董流昕;轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆參比分子的構(gòu)建[D];北京林業(yè)大學(xué);2005年

7 曹鵬;人腦膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)的鑒定[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2009年

8 胡伶俐;牛殺菌—通透性增加蛋白和防御素基因融合質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達(dá)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 佘其美;TNF-α、胰島素和地塞米松對穩(wěn)定表達(dá)人脂聯(lián)素3T3-L1細(xì)胞PPAR-γ2mRNA表達(dá)的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2005年

10 牛牛;COX-2基因和肺癌相關(guān)性研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2006年

本文編號：2855284