實(shí)踐及研究表明,急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的發(fā)病機(jī)制是個復(fù)雜的、多因素參與的病理生理過程,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。新近提出的“炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子學(xué)說”和“鈣超載學(xué)說”是近年關(guān)注的熱點(diǎn),在這些學(xué)說中有何種機(jī)制發(fā)揮重要作用呢?本課題組的前期動物實(shí)驗(yàn)表明ghrelin在大鼠AP胰腺組織中表達(dá)增高,且其表達(dá)水平隨著AP病情程度的加重而增加[1]。既往已有動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)外源性給予ghrelin可以減少AP炎癥介質(zhì)和炎癥因子的釋放,也可以引起胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高。由于ghrelin的廣泛分布及其所具有的多種生物學(xué)功能,我們推測內(nèi)源性ghrelin在AP的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用,而其作用機(jī)理是否與此類似?本文擬對此展開研究。 第一部分體外急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞模型構(gòu)建及細(xì)胞模型內(nèi)ghrelin的表達(dá) 目的：應(yīng)用雨蛙肽或脂多糖誘導(dǎo)大鼠AR42J胰腺腺泡細(xì)胞,以構(gòu)建體外AP胰腺腺泡細(xì)胞模型；研究ghrelin在正常AR42J細(xì)胞以及在雨蛙肽誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞構(gòu)建的AP胰腺腺泡細(xì)胞模型內(nèi)的表達(dá)情況。方法：應(yīng)用不同濃度雨蛙肽(0,10-8,10-7,10-6mol/L)或脂多糖(0,1,10,100mg/L)刺激大鼠AR42J細(xì)胞24h,采用底物酶法測定細(xì)胞上清液淀粉酶含量,RT-PCR方法測定細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子B (nuclear factor kappa B, NF-kB)p65、磷酸化IkB-α、L型鈣通道(L-type calcium channel, Cav1.2,Cav1.3)、P/Q型鈣通道(P/Q-type calcium channel, Cav2.1)、N型鈣通道(N-type calcium channel, Cav2.2)、T型鈣通道(T-type calcium channel,Cav3.1, Cav3.2)、 ghrelin mRNA表達(dá)水平,Western Blot方法測定細(xì)胞內(nèi)NF-kB p65、磷酸化IkB-α、Cav1.2、Cav1.3、ghrelin蛋白表達(dá)水平,Elisa方法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液白介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)蛋白表達(dá)水平,Fluo-4-am鈣離子熒光探針聯(lián)合激光共聚焦掃描顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)。 結(jié)果：1.不同濃度雨蛙肽或脂多糖干預(yù)AR42J細(xì)胞24h后,細(xì)胞培養(yǎng)液上清中淀粉酶含量與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。2.與對照組相比,不同濃度雨蛙肽作用24小時后,AR42J細(xì)胞NF-kB p65、IKB-α, Cav1.2、 Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1、Cav3.2mRNA (F=9.259,15.370,19.189,14.735,42.459,23.000,16.63, P0.05)及NF-kB p65、IkB-α、Cav1.2、Cav1.3蛋白表達(dá)水平(F=7.325,11.341,7.862,42.616,P＜0.05)均明顯增高；部分因子組內(nèi)比較(NF-kB p65、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.2mRNA及NF-kB p65、 IkB-α、Cav1.2、Cav1.3)呈劑量依賴性增高(P0.05), Cav2.2mRNA表達(dá)無明顯變化(F=2.121,P=0.138＞0.05)；不同濃度脂多糖作用24小時后的AR42J細(xì)胞上述基因mRNA表達(dá)水平均無明顯變化(F=0.552,0.174,0.491,0.182,0.185,0.509,0.125,0.350,P＞0.05)。3.不同濃度雨蛙肽作用24小時后,AR42J細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平較對照組均明顯增高,并呈劑量依賴性(F=102.185,349.787,P＜0.05)；不同濃度脂多糖對上述炎癥因子蛋白表達(dá)無顯著影響(F=1.720,0.514;P=0.203,0.6790.05); Elisa檢測各組AR42J細(xì)胞TNF-a的OD值過低,無法計算出相應(yīng)的蛋白濃度。4.不同濃度雨蛙肽作用24小時后,AR42J細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i較對照組均顯著增高,且不同濃度雨蛙肽組間[Ca2+]i比較呈劑量依賴性增高(F=421.939,P＜0.05)。5.雨蛙肽處理組AR42J細(xì)胞ghrelin mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高(F=45.128,67.2358,P＜0.05),并呈劑量依賴性(P0.05)。 結(jié)論：1.雨蛙肽和脂多糖刺激AR42J細(xì)胞前后,細(xì)胞培養(yǎng)上清液淀粉酶無明顯變化；2.雨蛙肽刺激能引起AR42J細(xì)胞多種炎癥因子和鈣通道基因mRNA、蛋白表達(dá)水平以及[Ca2+]i升高,提示AP胰腺腺泡細(xì)胞模型構(gòu)建成功；3.脂多糖刺激對AR42J細(xì)胞多種炎癥介質(zhì)和鈣通道基因mRNA及蛋白表達(dá)無顯著影響；4. ghrelin在大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J中存在高表達(dá),雨蛙肽刺激AR42J細(xì)胞后ghrelin mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組升高。 第二部分ghrelin miRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建、篩選及對AR42J細(xì)胞的靶向干擾效果 目的：篩選有效的大鼠ghrelin miRNA序列,構(gòu)建ghrelin miRNA慢病毒載體；應(yīng)用構(gòu)建的慢病毒ghrelin miRNA載體轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞,觀察其對細(xì)胞內(nèi)ghrelin基因表達(dá)的抑制情況。 方法：1.針對ghrelin基因構(gòu)建四個干擾質(zhì)粒：pcDNATM6.2-X207-1-3, pcDNATM6.2-X207-2-1, pcDNATM6.2-X207-3-1, pcDNATM6.2-X207-4-1;構(gòu)建高表達(dá)載體pCDNA3.1(+);干擾載體和高表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,qPCR檢測目的基因的表達(dá)情況,篩選出最佳干擾載體X207-1-3；使用BP重組系統(tǒng)和LR重組系統(tǒng)將目的片段從miRNA載體重組到慢病毒載體pLenti6.3/v5DEST上,篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證；用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體pLenti6.3-X207-1和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝病毒,收集病毒原液,超速離心濃縮,并測定滴度。2.將AR42J細(xì)胞分為5組：空白對照組、陰性對照組(MOI=100)、ghrelin-miRNA A組(MOI=50)、ghrelin-miRNA B組(MOI=80)、 ghrelin-miRNA C組(MOI=100)；應(yīng)用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)ghrelin mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：1.qPCR檢測4個miRNA序列對ghrelin基因的沉默效應(yīng),其中以pcDNATM6.2-X207-1-3下調(diào)最為明顯(86%)。2.選擇沉默效應(yīng)最明顯(86%)的序列包裝慢病毒,病毒滴度為1×108TU/ml。3. ghrelin miRNA能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)染入AR42J細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80%,RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示靶基因慢病毒轉(zhuǎn)染C組(MOI=100)細(xì)胞內(nèi)ghrelin mRNA和蛋白表達(dá)的干擾效果最明顯(P＜0.05)。 結(jié)論：成功構(gòu)建慢病毒ghrelin miRNA載體,并包裝出高滴度病毒,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；構(gòu)建的慢病毒ghrelin miRNA載體可以有效沉默AR42J細(xì)胞內(nèi)的ghrelin基因。 第三部分靶向干擾ghrelin基因?qū)毙砸认傺滓认傧倥菁?xì)胞炎癥通路及鈣通路的影響 目的：研究靶向抑制ghrelin表達(dá)對雨蛙肽刺激AR42J細(xì)胞構(gòu)建的AP胰腺腺泡細(xì)胞模型內(nèi)炎癥通路及鈣通路的變化。 方法：1.將AR42J細(xì)胞分為4組：空白對照組、雨蛙肽組、陰性對照+雨蛙肽組、ghrelin-miRNA+雨蛙肽組。2.應(yīng)用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)NF-kB p65、磷酸化IkB-α、Cav1.2、Cav1.3. Cav2.1mRNA及蛋白的表達(dá),Elisa方法檢測各組細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表達(dá)。3. Calcium CrimsonTM, AM鈣離子熒光探針標(biāo)記聯(lián)合激光共聚焦掃描顯微鏡測定各組[Ca2+]i。 結(jié)果：與雨蛙肽組和陰性對照+雨蛙肽組相比,ghrelin-miRNA+雨蛙肽組AR42J細(xì)胞：NF-KB p65、磷酸化IKB-αmRNA表達(dá)水平(F=51.255,9.266；P0.05)和蛋白表達(dá)水平顯著升高(F=7.533,18.876；P0.05),細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平顯著升高(F=334.554,336.462；P＜0.05)；Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1mRNA表達(dá)水平(F=37.208,55.651,42.640；P0.05)及Cavl.2、Cav1.3蛋白表達(dá)水平明顯降低(F=6.894,64.239; P0.05);[Ca2+]i明顯降低(F=61.358,P0.05)。 結(jié)論：靶向抑制AP胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)ghrelin基因的表達(dá),一方面可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá),另一方面可以減輕其細(xì)胞內(nèi)鈣超載。 第四部分全基因組基因芯片分析靶向干擾ghrelin基因?qū)毙砸认傺滓认傧倥菁?xì)胞基因表達(dá)譜特征的影響 目的：篩選靶向抑制ghrelin表達(dá)的AP胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)差異,并進(jìn)一步分析相關(guān)信號通路,以探討其分子生物學(xué)機(jī)制。 方法：1.將AR42J細(xì)胞分為2組：ghrelin-miRNA+雨蛙肽組、陰性對照+雨蛙肽組。2.實(shí)驗(yàn)干預(yù)后收集細(xì)胞提取RNA,并進(jìn)行RNA質(zhì)量鑒定。將總RNA合成為ds-DNA后進(jìn)行標(biāo)記,并與NimbleGen大鼠全基因組基因芯片雜交,運(yùn)用Axon GenePix4000B基因芯片掃描儀進(jìn)行掃描。3.所有基因水平文件輸入Agilent GeneSpring GX11.5.1軟件進(jìn)行聚類分級,進(jìn)一步進(jìn)行GO分析和通路分析。 結(jié)果：1. NimbleGen全基因組基因芯片篩選出ghrelin基因沉默及雨蛙肽誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞差異表達(dá)基因上調(diào)或下調(diào)2倍以上基因共2938個,其中表達(dá)上調(diào)基因1435個,表達(dá)下調(diào)基因1503個。2.GO分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在biological process分類中,與各種代謝過程相關(guān)的基因出現(xiàn)最多,其次為生物調(diào)節(jié)、進(jìn)化過程、細(xì)胞過程調(diào)節(jié)等；在cellular component分類中,改變最為顯著的差異表達(dá)基因主要位于細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)部分、細(xì)胞核、膜型細(xì)胞器等細(xì)胞成分中；在molecular function分類中,與結(jié)合相關(guān)的基因差異最多,包括蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、小分子結(jié)合等。3. Pathway分析結(jié)果顯示表達(dá)上調(diào)基因涉及31個信號通路,表達(dá)下調(diào)基因涉及30個信號通路。4.通過篩查與炎癥和鈣通路相關(guān)的差異表達(dá)基因,結(jié)果顯示,與CAMP/Ca2+信號通路相關(guān)的差異表達(dá)基因有60個,與炎癥通路相關(guān)的差異表達(dá)基因有199個。 結(jié)論：通過芯片結(jié)果、Pathway及GO分析等初步篩查發(fā)現(xiàn)：ghrelin對AP胰腺腺泡細(xì)胞的作用機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)代謝過程及離子、蛋白等結(jié)合功能有關(guān)；相關(guān)通路可能包括MAPK信號通路、細(xì)胞間粘附分子信號通路、焦點(diǎn)連接、Wnt信號通路、P53信號通路等。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R576
【文章目錄】：
英漢縮略詞對照表
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 體外急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞模型構(gòu)建及細(xì)胞模型內(nèi)ghrelin的表達(dá)
    1 材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第二部分 ghrelin miRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建、篩選及對AR42J細(xì)胞的靶向干擾效果
    1 ghrelin miRNA慢病毒干擾載體的構(gòu)建及篩選
        1.1 干擾載體的構(gòu)建
        1.2 全基因合成及高表達(dá)載體構(gòu)建
        1.3 干擾載體在HEK293細(xì)胞中的干擾評價
        1.4 干擾效果最佳的載體構(gòu)建為慢病毒干擾載體
        1.5 慢病毒的包裝和病毒滴度的測定
    2 慢病毒載體介導(dǎo)ghrelin miRNA轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞
    3 討論
    4 小結(jié)
第三部分 靶向干擾ghrelin基因?qū)毙砸认傺滓认傧倥菁?xì)胞炎癥通路及鈣通路的影響
    1 材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
第四部分 全基因組基因芯片分析靶向干擾ghrelin基因?qū)毙砸认傺滓认傧倥菁?xì)胞基因表達(dá)譜特征的影響
    1 材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號：2853605