病毒性肝炎(virus hepatitis)傳染性強(qiáng),發(fā)病率高,流行范圍廣,是全球最主要的傳染病之一。病毒性肝炎肝損傷主要由免疫介導(dǎo),在肝臟局部,肝細(xì)胞受HBV感染后激活免疫系統(tǒng),產(chǎn)生炎癥與化學(xué)趨化因子,將炎癥、淋巴細(xì)胞活化并募集至肝臟,這些炎癥和淋巴細(xì)胞的浸潤如果導(dǎo)致過強(qiáng)的免疫反應(yīng),則最終引起肝組織的損傷。因此,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和抑制肝臟炎癥是乙型肝炎治療的重要策略之一。 雙環(huán)醇(6-甲氧羰基-6'-羥甲基-2,3,2',3'-二亞甲基二氧基-4,4'-二甲氧基聯(lián)苯)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所劉耕陶院士和張純貞教授合作的科研小組歷經(jīng)15年艱辛研制成功,該藥降低轉(zhuǎn)氨酶作用顯著,對(duì)肝細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用,并具有抗肝纖維化的作用,長期使用無明顯不良反應(yīng)。雙環(huán)醇的問世為病毒性肝炎的治療提供了一種新的安全、有效的輔助治療藥物,其藥理基礎(chǔ)和作用機(jī)制均值得繼續(xù)深入研究。迄今為止,已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,雙環(huán)醇對(duì)四氯化碳(CCl_4)、D-氨基半乳糖、對(duì)乙酰氨基酚、脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝損傷均有保護(hù)作用,作用機(jī)制涉及抑制氧化和免疫損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞膜穩(wěn)定等。但尚缺乏雙環(huán)醇對(duì)病毒感染造成的肝臟炎癥的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究。 近年來關(guān)于病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的研究進(jìn)展表明,激活高等動(dòng)物天然免疫應(yīng)答的PAMPs廣泛存在于病原體細(xì)胞表面,識(shí)別PAMPs是以模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PPRs),Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)介導(dǎo)的。細(xì)菌和病毒的DNA作為一種PAMPs能被機(jī)體識(shí)別并激發(fā)免疫應(yīng)答,是因?yàn)槠浠蚪M中的一段以非甲基化CpG二核苷酸為核心的高保守序列,即CpG基序(CpG motif)。機(jī)體免疫系統(tǒng)通過TLR9(Toll-like receptor 9)特異識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序并形成受體復(fù)合物后,通過髓性分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD 88)依賴途徑,激活NF-κB(nuclear factor-κB)通路和應(yīng)激酶通路等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生Th1型細(xì)胞應(yīng)答和分泌炎癥因子,當(dāng)炎癥因子過度釋放時(shí),則造成宿主的炎癥或損傷。研究證實(shí)人工合成的含一個(gè)或數(shù)個(gè)非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核酸(CpGoligodeoxynucleotides,CpG-ODNs),也具有和細(xì)菌及病毒DNA中CpG基序一樣的免疫刺激效應(yīng)。因此,CpG-ODNs可用以模擬細(xì)菌和病毒等微生物病原侵入機(jī)體所引發(fā)的免疫反應(yīng)狀態(tài),構(gòu)建相應(yīng)的疾病模型。 目前已有研究小組構(gòu)建了CpG-DNA/LPS以及CpG-DNA/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型,為我們進(jìn)一步研究病毒感染后的肝臟炎癥免疫病理提供了可能的模型。本研究中,我們用CpG-ODN/D-GalN造成小鼠肝損傷,模擬小鼠感染DNA病毒后所引起的肝臟炎癥反應(yīng),來研究雙環(huán)醇的保護(hù)作用和機(jī)制。根據(jù)CpG-ODN的免疫活性具有種屬特異性的特征,第一部分研究中,我們以對(duì)小鼠具有最佳免疫效果的CpG1826構(gòu)建小鼠肝損傷模型;第二部分研究中,則以對(duì)人類最具免疫效應(yīng)的CpG2006模擬病毒刺激人正常細(xì)胞株L02細(xì)胞,從整體動(dòng)物和離體細(xì)胞兩個(gè)水平研究雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN造成的免疫性炎癥的保護(hù)作用,及其對(duì)TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路分子的活化和細(xì)胞因子分泌的作用。 1.雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制 目的:用CpG-ODN誘導(dǎo)D-GalN致敏的小鼠肝臟炎癥,研究雙環(huán)醇的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。 方法:BALB/C小鼠隨機(jī)分組,每組8只。第1至5天每天一次給小鼠灌胃300mg/kg和100mg/kg雙環(huán)醇或溶劑;第5天給藥后2小時(shí)由尾靜脈注射CpG-ODN(1826)20μg/D-GalN20mg/只,模型組僅在第5天尾靜脈注射CpG-ODN(1826)20μg/D-GalN20mg/只。12小時(shí)后處死小鼠并留取標(biāo)本。光鏡觀察肝臟損傷的程度;生物化學(xué)法測定血清中ALT;ELISA法測定血清及肝臟組織勻漿中細(xì)胞因子TNF-α,IL-18和IFN-γ及趨化因子MCP-1,MIP-lα和RANTES的水平;免疫組化法檢測肝臟中TLR9表達(dá);Westernblot方法測定NF-κB及MAPKs信號(hào)途徑相關(guān)分子,包括p65,p38和Erk1/2的變化。 結(jié)果:模型組小鼠血清ALT為557.33±69.51(U/L),比正常組小鼠ALT高6倍;雙環(huán)醇100mg/kg和300mg/kg組的ALT分別為227.67±55.59和138.45±22.52(U/L),與模型組相比分別降低59.1%和75.2%;肝臟組織病理切片結(jié)果顯示,雙環(huán)醇能減少肝臟炎癥細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞的溶解性壞死,減輕肝臟的損傷程度;雙環(huán)醇100mg/kg和300mg/kg組血清中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-18和IFN-γ的水平和趨化因子MCP-1、MIP-1α和Rantes的水平均顯著低于模型組,且具有劑量相關(guān)性。其中血清中TNF-α降低35.6%和72.4%;IL-18降低21.80%和47.4%;IFN-γ降低30.90%和63.3%,MCP-1降低30.5%和72.6%,MIP-1α降低28.7%和38.2%,Rantes降低25.4%和64.5%,都具有顯著差異;同時(shí),雙環(huán)醇對(duì)小鼠肝臟組織中的細(xì)胞因子和趨化因子也有類似的作用;免疫組化結(jié)果顯示,雙環(huán)醇處理組小鼠肝臟內(nèi)TLR9表達(dá)明顯少于模型組;Western blot結(jié)果則表明,雙環(huán)醇組p-NF-κB-p65、p-MAPK-p38和p-MAPK-Erkl/2的表達(dá)明顯低于模型組。 結(jié)論:雙環(huán)醇能夠抑制CpG-ODN/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥,其主要機(jī)制可能是通過參與小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,抑制炎癥因子TNF-α,IL-18,IFN-γ的過量表達(dá),同時(shí)抑制TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路中的有關(guān)分子的活化,通過參與小鼠免疫調(diào)節(jié),從多方面對(duì)CpG-ODN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷起到保護(hù)作用。 2.雙環(huán)醇對(duì)CpG-DNA誘導(dǎo)的L02細(xì)胞TLR9表達(dá)及炎癥、趨化因子分泌的抑制作用及其分子機(jī)制 研究表明,炎癥發(fā)生時(shí),肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞也參與了機(jī)體的免疫反應(yīng),能對(duì)炎癥信號(hào)作出反應(yīng),分泌一些炎癥細(xì)胞因子和趨化因子,并通過作用于臨近的肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤到肝臟的白細(xì)胞等發(fā)起、擴(kuò)大和改變炎癥反應(yīng)。CpG-ODN可直接作用于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,上調(diào)肝細(xì)胞上的粘附分子和共刺激分子,從而使肝細(xì)胞具有了類似于抗原遞呈細(xì)胞的功能,從而打破了機(jī)體的免疫耐受,對(duì)肝臟造成炎癥性損傷。因此,本部分研究中,我們以正常人肝細(xì)胞株L02作為研究對(duì)象,研究雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN刺激后的L02細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化因子及TLR9表達(dá)等的影響。 目的:以CpG2006模擬雙鏈DNA病毒刺激L02細(xì)胞并觀察雙環(huán)醇對(duì)L02細(xì)胞分泌炎癥、趨化因子,以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)TLR9表達(dá)的影響,研究雙環(huán)醇對(duì)與炎癥作用相關(guān)的分子的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制。 方法:用不同濃度雙環(huán)醇(0.01,0.1,0.5mM)與L02細(xì)胞溫孵2小時(shí)后,加入濃度為10μg/ml CpG-ODN2006,繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí),模型組僅加入10μg/mlCpG-ODN2006。用ELISA法測定培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-18及趨化因子MCP-1,RANTES和MIP-1α等水平;Western blot法和流式細(xì)胞術(shù)測定L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá);Western blot法測定細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65、p -p38-MAPK,pErk1/2-MAPK的變化。 結(jié)果:雙環(huán)醇能夠劑量依賴性地抑制CpG-ODN誘導(dǎo)的L02細(xì)胞趨化因子的釋放和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌,其中雙環(huán)醇0.5mM組和模型組相比,TNF-α、IL-18、MCP-1、MIP-1α和Rantes分別降低77.9%,88.7%,74.6%,63.3%和64.0%。Werstern blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致表明,雙環(huán)醇0.5mM和0.1mM能夠下調(diào)L02細(xì)胞內(nèi)經(jīng)ODN誘導(dǎo)表達(dá)的TLR9,同時(shí),還能抑制相關(guān)NF-κB通路蛋白p65和MAPK通路相關(guān)蛋白p38及ERK1/2的磷酸化。 結(jié)論:雙環(huán)醇能明顯抑制CpG-ODN誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞株L02炎癥因子和趨化因子的釋放與分泌,并且抑制L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)及相關(guān)NF-κB和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑分子的磷酸化活性。 綜上,本課題首次研究了雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用,并從整體動(dòng)物水平和離體細(xì)胞水平研究了雙環(huán)醇對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明,雙環(huán)醇能顯著降低CpG-ODN誘導(dǎo)上升的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶并改善肝臟病理情況。其機(jī)制可能與雙環(huán)醇既參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),又對(duì)肝細(xì)胞有直接的保護(hù)作用有關(guān)。雙環(huán)醇在體內(nèi)能抑制小鼠血清和肝組織中炎癥因子(TNF-α,IL-18,IFN-γ)和趨化因子MCP-1,MIP-1α,和RANTES的水平;同時(shí)也能直接抑制體外培養(yǎng)的L02細(xì)胞分泌這些因子。同時(shí),雙環(huán)醇還能下調(diào)L02細(xì)胞內(nèi)TLR9的表達(dá)及其信號(hào)途徑所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如NF-κB-p65,MAPK-p38和ERK1/2的活化。因此,雙環(huán)醇可以從多途徑減輕CpG-ODN對(duì)肝臟造成的損傷,從而達(dá)到治療肝炎的效果。這些研究結(jié)果也提示,雙環(huán)醇抗肝細(xì)胞炎癥的作用有免疫學(xué)機(jī)制的介入,為解釋雙環(huán)醇在臨床上治療肝炎的分子機(jī)制提供了更多的的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

2.3雙環(huán)醇對(duì)cpG一ODN誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織內(nèi)TLRg表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織內(nèi)弱表達(dá)TLRg，肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核清晰(圖1一3A)，而僅口服300m留kg雙環(huán)醇的小鼠的情況與正常小鼠類似(圖略)。小鼠經(jīng)CpG一ODN/D一GalN注射后，肝組織內(nèi)TLRg表達(dá)顯著上調(diào)增加，可見肝細(xì)胞內(nèi)褐色顆粒顯著增多(圖1一3B)。而預(yù)先使用雙環(huán)醇能下調(diào)TLRg的表達(dá)，而結(jié)果提示300m叭g組(圖1一3C)抑制效果強(qiáng)于100m留kg組(圖1一3D)o采用Image一Pr。 PLus5.1圖像分析軟件 (Mediaeybemeties)，以胞質(zhì)和胞膜染成棕黃色為陽性細(xì)胞，每一樣本隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(‘400)，計(jì)數(shù)每平方毫米內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果以萬士

都具有顯著差異。同時(shí)，雙環(huán)醇抑制CpG一ODN。一GalN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IFN一Y、TNF一a和IL一18的分泌作用與劑量呈相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.891、0.923和0.%8。而正常對(duì)照組與單用雙環(huán)醇300m妙g組相比則沒有顯著差異。(表1一5、圖1一4)。

化因子MCP一1、MIP一1。和RANTEs的作用與劑量呈相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.912、0.813和0.958。所測三個(gè)趨化因子在正常對(duì)照組與單用雙環(huán)醇300mg瓜g組小鼠血清中的表達(dá)沒有顯著差異。(表1一6、圖1一SA，1一SB)。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉旭東;張紅星;蔣陽昆;;雙環(huán)醇片降低谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶的臨床療效分析[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2011年08期

2 楊崎恩;蔣亦明;陸宇紅;;雙環(huán)醇聯(lián)合多烯磷脂酰膽堿治療脂肪肝臨床觀察[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2011年21期

3 高丹;;兩種藥物聯(lián)用治療非酒精性脂肪性肝炎的效果分析[J];中國醫(yī)藥科學(xué);2011年17期

4 蘇振和;;雙環(huán)醇治療酒精性肝病32例臨床觀察[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年14期

5 張為卿;;雙環(huán)醇片防治抗結(jié)核藥物致肝功能損害的臨床觀察[J];微量元素與健康研究;2011年05期

6 蘇翠萍;;雙環(huán)醇降低妊娠期轉(zhuǎn)氨酶46例療效觀察[J];中外醫(yī)療;2011年22期

7 史京萍;夏添松;丁強(qiáng);劉曉安;査小明;王水;;CpG寡核苷酸促進(jìn)Toll樣受體9的表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年08期

8 劉佩英;;雙環(huán)醇治療抗結(jié)核藥所致肝損害269例臨床療效觀察[J];中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè));2011年22期

9 李方學(xué);張為卿;李莉;張廣蕾;何榮梅;江波;;雙環(huán)醇治療非酒精性脂肪性肝炎的臨床觀察[J];首都醫(yī)藥;2011年14期

10 徐美琴;鄭文軍;黃翠麗;;三氧化二砷對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者Toll樣受體9及α-干擾素的影響[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 于紅燕;雙環(huán)醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

2 崔東來;抑制NF-κB誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

3 婁小娥;雙環(huán)醇對(duì)CpG-ODN誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2009年

4 谷雨;1.雙環(huán)醇對(duì)免疫性肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究 2.Beagle犬口服富馬酸泰諾福韋二吡呋酯和BP0018后血漿藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

5 于英男;1.雙環(huán)醇對(duì)Con A肝損傷小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響 2.雙環(huán)醇對(duì)順鉑中毒小鼠腎臟及肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

6 譚瑋;CYP450和P-糖蛋白與雙環(huán)醇及布格呋喃的相互作用[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

7 胡慶偉;雙環(huán)醇抗肝纖維化及其作用機(jī)制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

8 姚曉敏;雙環(huán)醇對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷和肝臟再生的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

9 王慧萍;雙環(huán)醇對(duì)小鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

10 趙菁;雙環(huán)醇對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷和肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 祁文玥;寧雙環(huán)醇對(duì)慢性乙型肝炎患者血清丙二醛水平的影響及其肝保護(hù)作用[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2011年

2 茹筱晨;雙環(huán)醇對(duì)超氧陰離子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能損傷的影響及其機(jī)制[D];浙江大學(xué);2010年

3 杜登泰;雙環(huán)醇對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡、線粒體膜電位和Casepase3的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

4 鄭樂;雙環(huán)醇聯(lián)合阿霉素對(duì)人淋巴瘤Raji細(xì)胞的影響[D];中南大學(xué);2012年

5 侯爽爽;雙環(huán)醇對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

6 董碩;雙環(huán)醇聯(lián)合化療對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D生長和凋亡的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

7 張潔;雙環(huán)醇對(duì)利福平、異煙肼在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

8 周亮亮;雙環(huán)醇對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

9 崔潔;雙環(huán)醇對(duì)抗大鼠心肌缺血復(fù)灌損傷作用的研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 盛楠;雙環(huán)醇對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞NF-κB活化調(diào)控機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2853566