病毒性肝炎(virus hepatitis)傳染性強,發(fā)病率高,流行范圍廣,是全球最主要的傳染病之一。病毒性肝炎肝損傷主要由免疫介導,在肝臟局部,肝細胞受HBV感染后激活免疫系統(tǒng),產(chǎn)生炎癥與化學趨化因子,將炎癥、淋巴細胞活化并募集至肝臟,這些炎癥和淋巴細胞的浸潤如果導致過強的免疫反應,則最終引起肝組織的損傷。因此,調(diào)節(jié)機體免疫反應和抑制肝臟炎癥是乙型肝炎治療的重要策略之一。 雙環(huán)醇(6-甲氧羰基-6'-羥甲基-2,3,2',3'-二亞甲基二氧基-4,4'-二甲氧基聯(lián)苯)由中國醫(yī)學科學院藥物研究所劉耕陶院士和張純貞教授合作的科研小組歷經(jīng)15年艱辛研制成功,該藥降低轉(zhuǎn)氨酶作用顯著,對肝細胞具有較好的保護作用,并具有抗肝纖維化的作用,長期使用無明顯不良反應。雙環(huán)醇的問世為病毒性肝炎的治療提供了一種新的安全、有效的輔助治療藥物,其藥理基礎(chǔ)和作用機制均值得繼續(xù)深入研究。迄今為止,已有大量動物實驗證明,雙環(huán)醇對四氯化碳(CCl_4)、D-氨基半乳糖、對乙酰氨基酚、脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)等化學物質(zhì)誘導的肝損傷均有保護作用,作用機制涉及抑制氧化和免疫損傷、細胞凋亡和細胞膜穩(wěn)定等。但尚缺乏雙環(huán)醇對病毒感染造成的肝臟炎癥的保護作用及其機制的研究。 近年來關(guān)于病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的研究進展表明,激活高等動物天然免疫應答的PAMPs廣泛存在于病原體細胞表面,識別PAMPs是以模式識別受體(Pattern recognition receptors,PPRs),Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)介導的。細菌和病毒的DNA作為一種PAMPs能被機體識別并激發(fā)免疫應答,是因為其基因組中的一段以非甲基化CpG二核苷酸為核心的高保守序列,即CpG基序(CpG motif)。機體免疫系統(tǒng)通過TLR9(Toll-like receptor 9)特異識別細菌和病毒DNA中的CpG基序并形成受體復合物后,通過髓性分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD 88)依賴途徑,激活NF-κB(nuclear factor-κB)通路和應激酶通路等信號轉(zhuǎn)導通路,促進機體產(chǎn)生Th1型細胞應答和分泌炎癥因子,當炎癥因子過度釋放時,則造成宿主的炎癥或損傷。研究證實人工合成的含一個或數(shù)個非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核糖核酸(CpGoligodeoxynucleotides,CpG-ODNs),也具有和細菌及病毒DNA中CpG基序一樣的免疫刺激效應。因此,CpG-ODNs可用以模擬細菌和病毒等微生物病原侵入機體所引發(fā)的免疫反應狀態(tài),構(gòu)建相應的疾病模型。 目前已有研究小組構(gòu)建了CpG-DNA/LPS以及CpG-DNA/D-GalN誘導的小鼠肝損傷模型,為我們進一步研究病毒感染后的肝臟炎癥免疫病理提供了可能的模型。本研究中,我們用CpG-ODN/D-GalN造成小鼠肝損傷,模擬小鼠感染DNA病毒后所引起的肝臟炎癥反應,來研究雙環(huán)醇的保護作用和機制。根據(jù)CpG-ODN的免疫活性具有種屬特異性的特征,第一部分研究中,我們以對小鼠具有最佳免疫效果的CpG1826構(gòu)建小鼠肝損傷模型;第二部分研究中,則以對人類最具免疫效應的CpG2006模擬病毒刺激人正常細胞株L02細胞,從整體動物和離體細胞兩個水平研究雙環(huán)醇對CpG-ODN造成的免疫性炎癥的保護作用,及其對TLR9介導的信號通路分子的活化和細胞因子分泌的作用。 1.雙環(huán)醇對CpG-ODN/D-GalN誘導的小鼠肝損傷的保護作用及其機制 目的:用CpG-ODN誘導D-GalN致敏的小鼠肝臟炎癥,研究雙環(huán)醇的保護作用及可能的機制。 方法:BALB/C小鼠隨機分組,每組8只。第1至5天每天一次給小鼠灌胃300mg/kg和100mg/kg雙環(huán)醇或溶劑;第5天給藥后2小時由尾靜脈注射CpG-ODN(1826)20μg/D-GalN20mg/只,模型組僅在第5天尾靜脈注射CpG-ODN(1826)20μg/D-GalN20mg/只。12小時后處死小鼠并留取標本。光鏡觀察肝臟損傷的程度;生物化學法測定血清中ALT;ELISA法測定血清及肝臟組織勻漿中細胞因子TNF-α,IL-18和IFN-γ及趨化因子MCP-1,MIP-lα和RANTES的水平;免疫組化法檢測肝臟中TLR9表達;Westernblot方法測定NF-κB及MAPKs信號途徑相關(guān)分子,包括p65,p38和Erk1/2的變化。 結(jié)果:模型組小鼠血清ALT為557.33±69.51(U/L),比正常組小鼠ALT高6倍;雙環(huán)醇100mg/kg和300mg/kg組的ALT分別為227.67±55.59和138.45±22.52(U/L),與模型組相比分別降低59.1%和75.2%;肝臟組織病理切片結(jié)果顯示,雙環(huán)醇能減少肝臟炎癥細胞浸潤及肝細胞的溶解性壞死,減輕肝臟的損傷程度;雙環(huán)醇100mg/kg和300mg/kg組血清中的細胞因子TNF-α、IL-18和IFN-γ的水平和趨化因子MCP-1、MIP-1α和Rantes的水平均顯著低于模型組,且具有劑量相關(guān)性。其中血清中TNF-α降低35.6%和72.4%;IL-18降低21.80%和47.4%;IFN-γ降低30.90%和63.3%,MCP-1降低30.5%和72.6%,MIP-1α降低28.7%和38.2%,Rantes降低25.4%和64.5%,都具有顯著差異;同時,雙環(huán)醇對小鼠肝臟組織中的細胞因子和趨化因子也有類似的作用;免疫組化結(jié)果顯示,雙環(huán)醇處理組小鼠肝臟內(nèi)TLR9表達明顯少于模型組;Western blot結(jié)果則表明,雙環(huán)醇組p-NF-κB-p65、p-MAPK-p38和p-MAPK-Erkl/2的表達明顯低于模型組。 結(jié)論:雙環(huán)醇能夠抑制CpG-ODN/D-GalN誘導的小鼠肝臟炎癥,其主要機制可能是通過參與小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用,抑制炎癥因子TNF-α,IL-18,IFN-γ的過量表達,同時抑制TLR9介導的信號通路中的有關(guān)分子的活化,通過參與小鼠免疫調(diào)節(jié),從多方面對CpG-ODN誘導的小鼠肝損傷起到保護作用。 2.雙環(huán)醇對CpG-DNA誘導的L02細胞TLR9表達及炎癥、趨化因子分泌的抑制作用及其分子機制 研究表明,炎癥發(fā)生時,肝實質(zhì)細胞也參與了機體的免疫反應,能對炎癥信號作出反應,分泌一些炎癥細胞因子和趨化因子,并通過作用于臨近的肝細胞、枯否氏細胞、內(nèi)皮細胞和浸潤到肝臟的白細胞等發(fā)起、擴大和改變炎癥反應。CpG-ODN可直接作用于肝實質(zhì)細胞,上調(diào)肝細胞上的粘附分子和共刺激分子,從而使肝細胞具有了類似于抗原遞呈細胞的功能,從而打破了機體的免疫耐受,對肝臟造成炎癥性損傷。因此,本部分研究中,我們以正常人肝細胞株L02作為研究對象,研究雙環(huán)醇對CpG-ODN刺激后的L02細胞分泌細胞因子、趨化因子及TLR9表達等的影響。 目的:以CpG2006模擬雙鏈DNA病毒刺激L02細胞并觀察雙環(huán)醇對L02細胞分泌炎癥、趨化因子,以及對細胞內(nèi)TLR9表達的影響,研究雙環(huán)醇對與炎癥作用相關(guān)的分子的調(diào)節(jié)作用和機制。 方法:用不同濃度雙環(huán)醇(0.01,0.1,0.5mM)與L02細胞溫孵2小時后,加入濃度為10μg/ml CpG-ODN2006,繼續(xù)培養(yǎng)18小時,模型組僅加入10μg/mlCpG-ODN2006。用ELISA法測定培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-18及趨化因子MCP-1,RANTES和MIP-1α等水平;Western blot法和流式細胞術(shù)測定L02細胞內(nèi)TLR9的表達;Western blot法測定細胞內(nèi)p-NF-κB p65、p -p38-MAPK,pErk1/2-MAPK的變化。 結(jié)果:雙環(huán)醇能夠劑量依賴性地抑制CpG-ODN誘導的L02細胞趨化因子的釋放和TNF-α等細胞因子的分泌,其中雙環(huán)醇0.5mM組和模型組相比,TNF-α、IL-18、MCP-1、MIP-1α和Rantes分別降低77.9%,88.7%,74.6%,63.3%和64.0%。Werstern blot和流式細胞術(shù)結(jié)果一致表明,雙環(huán)醇0.5mM和0.1mM能夠下調(diào)L02細胞內(nèi)經(jīng)ODN誘導表達的TLR9,同時,還能抑制相關(guān)NF-κB通路蛋白p65和MAPK通路相關(guān)蛋白p38及ERK1/2的磷酸化。 結(jié)論:雙環(huán)醇能明顯抑制CpG-ODN誘導的人肝細胞株L02炎癥因子和趨化因子的釋放與分泌,并且抑制L02細胞內(nèi)TLR9的表達及相關(guān)NF-κB和MAPK信號傳導途徑分子的磷酸化活性。 綜上,本課題首次研究了雙環(huán)醇對CpG-ODN誘導的小鼠肝損傷的保護作用,并從整體動物水平和離體細胞水平研究了雙環(huán)醇對肝細胞的保護作用機制。結(jié)果表明,雙環(huán)醇能顯著降低CpG-ODN誘導上升的小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶并改善肝臟病理情況。其機制可能與雙環(huán)醇既參與機體的免疫調(diào)節(jié),又對肝細胞有直接的保護作用有關(guān)。雙環(huán)醇在體內(nèi)能抑制小鼠血清和肝組織中炎癥因子(TNF-α,IL-18,IFN-γ)和趨化因子MCP-1,MIP-1α,和RANTES的水平;同時也能直接抑制體外培養(yǎng)的L02細胞分泌這些因子。同時,雙環(huán)醇還能下調(diào)L02細胞內(nèi)TLR9的表達及其信號途徑所涉及的信號轉(zhuǎn)導分子如NF-κB-p65,MAPK-p38和ERK1/2的活化。因此,雙環(huán)醇可以從多途徑減輕CpG-ODN對肝臟造成的損傷,從而達到治療肝炎的效果。這些研究結(jié)果也提示,雙環(huán)醇抗肝細胞炎癥的作用有免疫學機制的介入,為解釋雙環(huán)醇在臨床上治療肝炎的分子機制提供了更多的的理論依據(jù)。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

2.3雙環(huán)醇對cpG一ODN誘導的小鼠肝臟組織內(nèi)TLRg表達的影響免疫組化結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織內(nèi)弱表達TLRg，肝細胞形態(tài)正常，胞質(zhì)豐富，細胞核清晰(圖1一3A)，而僅口服300m留kg雙環(huán)醇的小鼠的情況與正常小鼠類似(圖略)。小鼠經(jīng)CpG一ODN/D一GalN注射后，肝組織內(nèi)TLRg表達顯著上調(diào)增加，可見肝細胞內(nèi)褐色顆粒顯著增多(圖1一3B)。而預先使用雙環(huán)醇能下調(diào)TLRg的表達，而結(jié)果提示300m叭g組(圖1一3C)抑制效果強于100m留kg組(圖1一3D)o采用Image一Pr。 PLus5.1圖像分析軟件 (Mediaeybemeties)，以胞質(zhì)和胞膜染成棕黃色為陽性細胞，每一樣本隨機選取5個高倍視野(‘400)，計數(shù)每平方毫米內(nèi)陽性細胞數(shù)。結(jié)果以萬士

都具有顯著差異。同時，雙環(huán)醇抑制CpG一ODN。一GalN誘導的細胞因子IFN一Y、TNF一a和IL一18的分泌作用與劑量呈相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.891、0.923和0.%8。而正常對照組與單用雙環(huán)醇300m妙g組相比則沒有顯著差異。(表1一5、圖1一4)。

化因子MCP一1、MIP一1。和RANTEs的作用與劑量呈相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.912、0.813和0.958。所測三個趨化因子在正常對照組與單用雙環(huán)醇300mg瓜g組小鼠血清中的表達沒有顯著差異。(表1一6、圖1一SA，1一SB)。
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本文編號：2853566