背景與目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn),其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌。在我國,該病已成為最主要的慢性肝臟疾病之一,約占我國肝臟疾病比例的49.3%。雖然目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到飲食習(xí)慣改變、環(huán)境和遺傳因素等共同導(dǎo)致的胰島素抵抗、肥胖和腸道菌群改變等是NAFLD的發(fā)病基礎(chǔ),但NAFLD特別是NASH的發(fā)病機(jī)制仍有待深入闡明。脯氨酰內(nèi)肽酶(PREP)是一種由約700個(gè)氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶,能特異性水解含不多于30~40個(gè)氨基酸的肽鏈中的脯氨酸殘基。有研究表明,PREP與胰島素釋放、攝食行為、器官炎癥性疾病、炎癥細(xì)胞因子代謝和肝再生等密切相關(guān)。前期體外研究發(fā)現(xiàn)PREP可抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變,然而,目前尚未見PREP參與NAFLD發(fā)病的體內(nèi)研究報(bào)道。為此,本研究采用高脂高膽固醇飲食建立小鼠NAFLD模型,結(jié)合PREP特異性抑制劑KYP-2047,觀察PREP在NAFLD進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化和對(duì)疾病發(fā)展的影響。方法:雄性野生型C57BL/6J小鼠分成兩部分實(shí)驗(yàn)。第一部分將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組,分別給予高脂高膽固醇飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)4w、8w、12w和16w。第二部分將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組。對(duì)照組飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料,模型組和干預(yù)組持續(xù)飼以高脂高膽固醇飼料,飼養(yǎng)10周后,干預(yù)組予以皮下植入膠囊滲透泵持續(xù)穩(wěn)定注射PREP特異性抑制劑KYP-2047,劑量為5mg/kg(體質(zhì)量)/d,對(duì)照組和模型組相應(yīng)注射等量生理鹽水,持續(xù)干預(yù)6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠,收集血清和肝組織等保存待檢測(cè)。采用自動(dòng)生化儀測(cè)定血清生化指標(biāo);采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清空腹胰島素水平;采用Suc-Gly-Pro-AMC底物法檢測(cè)肝組織和血清中PREP活性;采用蘇木素-伊紅染色及Masson染色觀察肝臟病理學(xué)改變,并計(jì)算NAFLD活動(dòng)度積分(NAS);采用熒光定量PCR法、Western blot法或免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)肝組織PREP、基質(zhì)金屬蛋白酶-8/9、胸腺素β4、金屬蛋白酶Meprin-α以及炎癥、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:高脂高膽固醇飲食處理滿4w時(shí)小鼠可形成輕度脂肪變性,滿8w可達(dá)早期NASH,此后NASH呈進(jìn)行性發(fā)展,滿16w模型組小鼠出現(xiàn)顯著代謝紊亂;肝組織PREP蛋白水平在對(duì)照組和模型組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但從8w開始模型組血清中PREP活性隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)呈動(dòng)態(tài)升高,至造模16周,肝內(nèi)和血清中活性均顯著高于對(duì)照組(p均0.05)。在造模12w末和16w末,模型組肝組織內(nèi)PREP m RNA、基質(zhì)金屬蛋白酶8/9 m RNA相對(duì)表達(dá)量和基質(zhì)金屬蛋白酶8/9蛋白水平均顯著高于對(duì)照組(p均0.05),而胸腺素β4、Meprin-α蛋白水平均低于對(duì)照組(p均0.05)。抑制劑干預(yù)研究發(fā)現(xiàn),模型組肝組織內(nèi)炎癥因子及成脂相關(guān)基因表達(dá)增加,經(jīng)過6周PREP特異性抑制劑KYP-2047干預(yù)后,肝組織內(nèi)升高的PREP活性被顯著抑制,干預(yù)組小鼠肝臟炎癥和脂肪變明顯減輕,肝酶、胰島素抵抗指數(shù)、炎癥和脂質(zhì)代謝相關(guān)因子均顯著改善。結(jié)論:小鼠肝組織PREP活性在NASH階段顯著升高,可能參與小鼠NASH的進(jìn)展;應(yīng)用PREP特異性抑制劑能顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH階段肝臟炎癥和脂肪變,這一作用伴隨肝內(nèi)炎癥因子表達(dá)下調(diào)、脂代謝相關(guān)因子和胰島素抵抗改善。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

高脂飲食 12w 末，模型組小鼠肝臟紅偏黃，體積較腫大，部分被膜不光滑，邊緣較頓，切面明顯油膩感，質(zhì)地欠軟（圖 1G）。高脂飲食 16w 末，模型組小鼠上述改變更加明顯，肝臟色澤偏黃，體積明顯腫大，被膜不光滑，邊緣頓，切面明顯油膩感，質(zhì)地不柔軟（圖 1H）。

肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝血竇清晰，肝細(xì)胞大小相似，胞質(zhì)豐富，核圓位于細(xì)胞中央（圖2A、2B、2C、2D）。高脂飲食 4w 末，模型組肝組織出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量微小的脂肪空泡，肝索、肝竇較清晰，肝小葉分界清楚，部分可見輕度肝細(xì)胞水腫，細(xì)胞內(nèi)胞漿豐富，核居中，匯管區(qū)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 2E）。高脂飲食 8w 末，模型組肝組織出現(xiàn)輕中度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)中等量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇變形狹窄，小葉結(jié)構(gòu)消失，部分可見氣球樣變性（圖 2F）。高脂飲食 12w 末，模型組出現(xiàn)中重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，肝細(xì)胞胞漿疏松，氣球樣變性多見，匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 2G）。高脂飲食 16w 末，模型組出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量大泡性脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇消失，肝細(xì)胞廣泛氣球樣變性，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和點(diǎn)狀壞死（圖 2H）。各組小鼠肝臟 NAS 評(píng)估結(jié)果見表 9。在 8w、12w 和 16w 末，分別有 5 只、8 只和 10 只小鼠 NAS＞=4 分。

通大學(xué)碩士學(xué)位論文 Shanghai Jiaotong U組小鼠 PREP 及相關(guān)蛋白肝內(nèi)的表達(dá)情況。1 各組小鼠肝組織中 PREP mRNA 和蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組相比，模型組肝內(nèi) PREPmRNA 相對(duì)表達(dá)量伴隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)趨勢(shì)，并在造模 12w 和 16w 末，相比于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜ 3A），但蛋白水平在各個(gè)周期末，模型組和對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 周達(dá);陳源文;范建高;;脯氨酰寡肽酶的肝內(nèi)生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2015年01期

本文編號(hào)：2852777