目的：構(gòu)建并鑒定靶向大鼠TGF-β1基因的短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA，shRNA)真核表達載體，制備負載重組質(zhì)粒PGenesil-TGF-β1的殼聚糖納米粒,并研究殼聚糖-pDNA納米粒的結(jié)構(gòu)特征和性能特點,為進一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。方法：1.根據(jù)RNA干擾序列設(shè)計原則和大鼠TGF-β1基因的mRNA序列挑選出兩個大鼠TGF-β1基因的RNA干擾靶位，即TGF-β1基因的769-787nt(命名為TGF-β1-A)和1033-1051nt(命名為TGF-β1-B)，再按CACC+Sense+Loop+Antisense+終止信號+Sac I結(jié)構(gòu)設(shè)計合成2對編碼shRNA的特異性寡核苷酸片段,另選用通用陰性對照序列HK為陰性對照，將上述片段退火形成雙鏈DNA后分別克隆進入線性化質(zhì)粒載體PGenesil-1.1中，構(gòu)建成含目的靶基因片段的shRNA真核表達載體PGenesil-TGF-β1-A、 PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK，并對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定及測序分析。2.采用復凝聚法制備殼聚糖-質(zhì)粒PGenesil-TGF-β1微粒體，通過透射電鏡測定殼聚糖-PGenesil-TGF-β1納米粒的形態(tài)、粒徑大小；采用凝膠電泳阻滯實驗驗證殼聚糖-pDNA復合物的形成并觀察殼聚糖納米粒與質(zhì)粒的結(jié)合能力；DNaseI消化實驗考察殼聚糖納米粒保護質(zhì)粒DNA抵抗核酸酶的能力；用全光譜分光光度計測定該復合物的包封率大小。結(jié)果：1.經(jīng)酶切證實靶向大鼠TGF-β1基因的表達shRNA的目的基因片段分別被成功地克隆到質(zhì)粒載體PGenesil-1.1中，測序結(jié)果進一步證明重組質(zhì)粒的插入序列與設(shè)計的靶基因片段完全一致。2.采用復凝聚法制備的包裹重組質(zhì)粒的殼聚糖-PGenesil-TGF-β1-A納米粒及殼聚糖-PGenesil-TGF-β1-B納米粒均呈球形，微粒直徑在100-200nm之間，平均約(127.37±19.75)nm；凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果表明殼聚糖納米粒能通過靜電作用有效結(jié)合質(zhì)粒，將其包裹在內(nèi)，DNase I消化實驗則示殼聚糖納米粒能有效地保護質(zhì)粒免受核酸酶的降解；制備的殼聚糖PGenesil-TGF-β1-A納米粒和殼聚糖PGenesil-TGF-β1-B納米粒的包封率分別為(94.38±0.45)%和(93.19±3.21)%，均大于90%。結(jié)論：成功構(gòu)建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表達載體。用復凝聚法制得的殼聚糖-PGenesil-TGF-β1納米粒直徑在100-200nm之間，有較高的包封率，可有效凝聚pDNA，并能保護質(zhì)粒免受核酸酶的降解，為后續(xù)研究抗肝纖維化的基因藥物奠定了實驗基礎(chǔ)。
【學位單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R575.2;R450
【部分圖文】：

Table 1 Design of rat TGF-β1 sequence of shRNA稱 序列: 5'-CACCGAACCAAGGAGACGGAATATTCAAGACGCGTCTCCTTGGTTC TTTTTT G -3': 5'-AGCTCAAAAAAGAACCAAGGAGACGGAATA CGTCTTGAACGTCTCCTTGGTTC -3': 5'-CACCGCAGCTGTACATTGACTTTCTATGGACATCAATGTACAGCTGC TTTTTT G -3': 5'-AGCTCAAAAAAGCAGCTGTACATTGACTTTTGTCCATAGTCAATGTACAGCTGC -3': 5'-CACCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGCGCCTTATGAAGTC TTTTTT G -3':5'-AGCTCAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAACGCCTTATGAAGTC -3'

pGenesil-1.1 的線性化即 BsaI 酶切電r；1 和 2：質(zhì)粒 pGenesil-1.1 用 BsaI erogram of pGenesil-1.1 digested with rer；1and 2：The pGenesil-1.1 with Bs酶切鑒定結(jié)果enesil-1.1 的多克隆位點(MCS)如在插入的目的基因片段里，我們esil-1.1 本來就有一個 Sac I 的酶被 Sac I 酶切出一條約 916bp 的F-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B 及

圖 3 重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖； 1：裸重組質(zhì)粒 PGenesil-TGF-β1-A；2: 重組：裸重組質(zhì)粒 PGenesil-TGF-β1-B；4：重組質(zhì)粒裸重組質(zhì)粒 PGenesil-HK；6：重組質(zhì)粒 PGeneFig.3 Electropherogram of digested recombinant er; 1 ： Naked recombinant PGenesil-TGF-β1-A with SacI digestion；3：Naked recombinant enesil-TGF-β1-B with SacI digestion；5：Naked re PGenesil-HK with SacI digestion序鑒定結(jié)果
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本文編號：2852310