第一部分:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)以及HLA-G5表達的初步研究 背景間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新和多向分化的潛能,并具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用,能抑制同種異體免疫排斥反應(yīng),是一種較為理想的組織工程種子細(xì)胞,但具體的免疫調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明。研究表明,MSCs可以低水平表達人白細(xì)胞抗原HLA-I類分子而不表達HLA-Ⅱ類分子、CD80、CD86、CD40或CD40L共刺激分子,因此MSC不能觸發(fā)T細(xì)胞激活。HLA-G5是一種非經(jīng)典的HLA-I類分子,具有多種免疫抑制功能,如NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解,同種異體基因T細(xì)胞增殖,以及樹突細(xì)胞成熟。鑒于HLA-G5和MSCs都具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì),本實驗從人臍帶中分離獲取MSCs,觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是否表達HLA-G5,并研究其在MSCs介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)功能中的作用。 目的從臍帶中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞并予以鑒定,并研究HLA-G5在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中表達及其對T細(xì)胞體外的負(fù)性協(xié)同作用。 方法采用雙酶消化法分離臍帶組織,進行貼壁分離和傳代培養(yǎng),通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志的表達,并進行成脂、成骨誘導(dǎo)鑒定;采用蛋白質(zhì)印記法(western blot)檢測UC-MSCs中HLA-G5蛋白水平的表達,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測重組人白細(xì)胞介素10(rhIL-10)干預(yù)后UC-MSCs培養(yǎng)上清中HLA-G5的含量變化;3H-TdR摻入法檢測UC-MSCs對PHA刺激后的T細(xì)胞增殖的影響以及HLA-G5單克隆抗體部分阻斷UC-MSCs抑制T細(xì)胞增殖的影響,ELISA法檢測培養(yǎng)基上清液中細(xì)胞因子水平,以及HLA-G5單克隆抗體阻斷作用后細(xì)胞因子水平的變化。 結(jié)果(1)UC-MSCs貼壁生長,呈成纖維細(xì)胞形態(tài),表達CD73、CD90、CD105,但不表達CD34、CD45、HLA-DR分子,在體外能向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化;(2)UC-MSCs表達37kDa的HLA-G5蛋白,且隨著細(xì)胞傳代,HLA-G5表達量下降;(3)rhIL-10干預(yù)后UC-MSCs培養(yǎng)基上清液中HLA-G5含量明顯增高(P0.05),并存在劑量依賴性;(4)UC-MSCs可抑制活化T細(xì)胞體外增殖,并調(diào)節(jié)IL-4、IFN-γ的分泌,使用HLA-G5mAb阻斷后,抑制效果減弱。 結(jié)論采用雙酶消化法可以成功分離培養(yǎng)出UC-MSCs;UC-MSCs在體外具有抑制T細(xì)胞活化和增殖的作用,其表達的HLA-G5因子具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。 第二部分:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性肝衰竭的療效觀察 背景急性肝衰竭具有進展快,并發(fā)癥多,治療難度大,死亡率高,預(yù)后極差的特點,是當(dāng)前肝臟疾病治療的熱點與難點,發(fā)病機制復(fù)雜,目前認(rèn)為是由于機體免疫反應(yīng)過強,短期內(nèi)過強T細(xì)胞毒反應(yīng),迅速破壞大量肝細(xì)胞,引起大塊狀肝臟壞死。肝移植是治療這種疾病的有效方法,但面臨許多問題,如:供體缺乏、手術(shù)創(chuàng)傷大、排異反應(yīng)、費用昂貴等,為此,迫切需要尋找治療肝衰竭新方法。UC-MSCs可以在體內(nèi)增殖、分化為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞,替代受損的肝細(xì)胞,促進肝功能恢復(fù)。目前,對于MSCs治療肝衰竭作用機制的研究主要集中在MSCs的分化潛能方面,然而研究發(fā)現(xiàn),MSCs在體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞需要7-14天,體內(nèi)分化也需要4-5天,而MSCs在移植的早期未分化為肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞時即顯示出顯著的療效,用干細(xì)胞分化機制不足以解釋MSCs移植的這種早期應(yīng)答。那么MSCs對大鼠急性肝衰竭(Acute Liver Failure,ALF)早期作用機制如何?是本部分的研究重點。 目的探討UC-MSCs移植治療對急性肝衰竭大鼠的肝功能、生存率和相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的影響,以及HLA-G5參與UC-MSCs免疫調(diào)節(jié)功能在治療中的重要性。 方法采用D-GAL聯(lián)合LPS腹腔注射的方法制作大鼠肝衰竭模型;按第一部分的方法從臍帶中分離培養(yǎng)出rhIL-10干預(yù)培養(yǎng)的UC-MSCs(HLA-G5高表達)及正常UC-MSCs,并利用CFSE進行標(biāo)記;將兩組細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植治療大鼠肝功能衰竭模型各16只,并與模型對照組(n=16)進行比較,觀察三組大鼠一般狀況、生存率等情況,動態(tài)檢測肝功能及肝臟病理變化,熒光顯微鏡下觀察MSCs歸巢至肝臟的情況,以及ELISA檢測血漿中IL-4、IFN-γ含量變化。 結(jié)果經(jīng)CFSE標(biāo)記的UC-MSCs染色后可見較強的綠色熒光,細(xì)胞標(biāo)記率接近99%。造模后大鼠逐漸進入肝衰竭狀態(tài),表現(xiàn)為拒食,活動明顯減少,萎靡、嗜睡或逐漸發(fā)展為昏迷狀態(tài),對外界刺激反應(yīng)較遲鈍,全身毛蓬松無光澤,尿失禁,尿色深黃;生化檢查發(fā)現(xiàn)肝功能嚴(yán)重?fù)p害,組織學(xué)檢查顯示肝細(xì)胞大片壞死、大量炎性細(xì)胞浸潤。從移植術(shù)后3d開始,實驗組和移植對照組存活大鼠一般情況明顯好于模型對照組;肝功能及肝臟組織學(xué)改善,實驗組肝功能明顯好于移植對照組。與正常大鼠比較,模型組血漿IFN-γ水平明顯升高(P0.05),而IL-4水平無明顯差異(P0.05),UC-MSCs治療后,血漿IFN-γ水平明顯降低,而IL-4水平明顯升高,高表達HLA-G5的UC-MSCs治療后IL-4變化更明顯(P0.05)。 結(jié)論UC-MSCs經(jīng)尾靜脈移植治療大鼠肝衰竭模型,能夠促進大鼠肝功能修復(fù),減輕肝臟組織的炎癥反應(yīng),對急性肝功能衰竭具有明顯治療作用。UC-MSCs可利用免疫調(diào)節(jié)作用使促炎因子與抗炎因子達到新的平衡,且HLA-G5參與此過程,這可能是UC-MSCs移植治療ALF的作用機制之一。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R575.3
【部分圖文】：

經(jīng) 2 次換液后，混雜細(xì)胞基本脫落，留下形態(tài)均一的梭形細(xì)胞，10d 左右，梭形細(xì)胞增殖加快，至 15-20d，原代細(xì)胞可鋪滿瓶底達 80%以上，細(xì)胞間界限不清，細(xì)胞呈長梭狀，最終匯合成均質(zhì)的長梭形細(xì)胞單層，呈明顯的漩渦狀、輻射狀排列 (見圖1.1)。經(jīng)胰酶消化，傳代細(xì)胞在 12h 內(nèi)完全貼壁、伸展，呈長梭形，周期一般為 5～10d。多次傳代后，細(xì)胞仍呈均質(zhì)的梭形細(xì)胞群，漩渦狀方式生長，并保持很強的增殖活性。4.2 UC-MSCs 的體外生長曲線UC-MSCs 原代細(xì)胞生長周期約為 20d，第 12d 為生長高峰期。細(xì)胞經(jīng)過傳代后，前 3d 細(xì)胞生長較慢，為潛伏期。第 4 天后進入細(xì)胞快速增殖期，1 周以后進入平臺期。群體倍增時間約 24 h。1、3、5 代細(xì)胞生長曲線基本相同（見圖 1.2）。4.3 UC-MSCs 免疫表型的檢測取 3 代以后的 UC-MSCs 進行流式分析

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)生長曲線

UC-MSCs成脂肪誘導(dǎo)鑒定，油紅O染色（×100）
【參考文獻】

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本文編號：2852119