【摘要】：【目的】探索原代培養(yǎng)胰腺腺泡細胞方法并鑒定所培養(yǎng)細胞的性質(zhì)，為急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)體外模型的構(gòu)建創(chuàng)造條件，通過促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)對胰腺腺泡細胞和肺組織保護作用的研究，為今后EPO治療AP的臨床應用提供理論依據(jù)。 【方法】分離提純胰腺腺泡細胞，將其置于DMEM-F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，24h后電子顯微鏡下觀察胰腺腺泡細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，并運用PaA抗體鑒定培養(yǎng)細胞性質(zhì)。90只Sprague-Dawley(SD)大鼠分為假手術(shù)組(sham-operation group, SO)，SAP(Severeacute pancreatitis, SAP)組，EPO1000組，EPO3000組，EPO5000組，每組18只，分別按以下時間24h、48h、72h隨機處死6只。逆行胰膽管注射5%�；悄懰徕c(sodiumtaurocholate, STC)（0.1ml/100g)制備SAP大鼠模型。測大鼠肺、胰腺干濕比重及體重系數(shù)，人工碘比色法測血清AMS，Elisa試劑盒測IL-1、IL-6和TNF-α，分析3種炎性因子的相互關(guān)系；HE染色觀察胰腺和肺組織病理變化，免疫組化法檢測胰腺組織中EPOR的表達，Elisa法檢測EPOR表達水平。 【結(jié)果】①新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細胞懸浮在培養(yǎng)液中，形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)與細胞核比例較大。分離純化后腺泡細胞絕大多數(shù)呈圓形或橢圓形，細胞核呈圓形，偏于一側(cè)，細胞間雜質(zhì)較少。②24h后可見細胞數(shù)有所增加，細胞明顯聚集，2～3天換液后觀察細胞，細胞活性好，細胞數(shù)目明顯增多，傳代良好。③經(jīng)臺盼藍染色測定細胞活性達96%以上，符合進一步實驗要求。④電鏡下，大量的酶原顆粒位于細胞頂部的胞質(zhì)內(nèi)，細胞內(nèi)可見發(fā)達的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在酶原顆粒聚集的區(qū)域可見高爾基復合體。⑤經(jīng)PaA抗體檢測腺泡細胞在免疫熒光鏡下呈現(xiàn)大片綠色熒光。⑥SAP組大鼠肺臟干濕比重大于SO組(P0.05)，經(jīng)EPO治療后，肺、胰腺水腫減輕；SAP組大鼠體重系數(shù)亦大于SO組和EPO組(P0.05)；⑦SAP組與EPO組血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯高于SO組，經(jīng)EPO治療24h和48h后，測血清AMS明顯降低（P0.05），SAP組和EPO組各時間點的血清炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均高于SO組, SAP組升高顯著，48h達到峰值，72h有所回落，經(jīng)EPO治療后各指標均有下降，EPO療效呈時間依賴性，三者之間呈正相關(guān)性(r=0.534, p=0.02; r=0.584, p=0.04; r=0.820，p=0.00)，有相互促進表達作用。⑧SO組胰腺和肺組織均無明顯病理變化；SAP組大鼠胰腺和肺組織出現(xiàn)不同程度水腫、滲出、炎癥細胞浸潤，部分組織出現(xiàn)出血、壞死、空泡形成，細胞間結(jié)構(gòu)模糊，甚至連接成片；EPO治療組胰腺和肺組織病理損傷程度明顯改善，病理評分顯著低于SAP組（P0.05）。組間比較顯示：除EPO3000和EPO5000間無統(tǒng)計學意義外，其他各組間差異均有統(tǒng)計學意義。⑨EPO治療組、假手術(shù)組大鼠胰腺和肺組織中，可見散在的EPOR陽性表達，染色位置位于胞漿；不同劑量EPO治療組中EPOR在胰腺和肺組織中均呈現(xiàn)大片深染的陽性表達。⑩ELISA法測EPOR表達量示：假手術(shù)組、SAP組EPO1000組中EPOR表達量的變化不顯著，差異無統(tǒng)計學意義，EPOR表達量隨EPO劑量的增加而增加。 【結(jié)論】①本實驗方法可成功原代培養(yǎng)胰腺腺泡細胞，培養(yǎng)細胞純度及存活率高，符合體外實驗要求；②PaA抗體可成為鑒定胰腺腺泡細胞的一種便捷、可行的方法，其特異性高，可推廣應用于鑒定胰腺腺泡細胞；③SAP組大鼠血清中炎癥介質(zhì)IL-1、IL-6、TNF-α水平呈逐漸升高趨勢；EPO可有效減輕胰腺和肺組織病理損傷，降低SAP大鼠血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平；④ELISA法及免疫組化法檢測出胰腺腺泡細胞上EPOR的表達，其表達量隨EPO劑量的增加而增加，但與治療時間無明顯相關(guān)性，由此推測EPO可與EPOR結(jié)合后，激活下游的細胞信號轉(zhuǎn)導通路，從而起到抗炎的作用。
【學位授予單位】：廣東藥學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R576
【圖文】：

填滿標本表面，暗室內(nèi)放置 30min，PB分，光學樹脂封片后于免疫熒光鏡下觀大鼠胰腺腺泡細胞微鏡下，新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細胞不規(guī)則形間質(zhì)細胞及細胞碎片單個胰腺，直徑約為紅細胞的 4～6 倍，細胞質(zhì)

圖 1 新鮮分離的大鼠胰腺腺泡細胞Fig.1 Freshly isolated acinar cells (o.m分離液分離純化后的胰腺腺泡細胞細胞分離液分離純化細胞后可見絕大多質(zhì)與細胞核比例較大，核圓形，偏于一

圖 3 培養(yǎng) 12h 后的胰腺腺泡細胞Fig.3 after 12 h culture (o.m 40×)后的胰腺腺泡細胞數(shù)有所增加，細胞聚集明顯，可見多數(shù)細胞胞活性好，細胞數(shù)目明顯增多，傳代良好
【參考文獻】

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1 劉學進;陳墾;龍友明;王暉;謝文瑞;;不同濃度的脂多糖刺激AR42J細胞對NF-κB及ICAM-1表達的影響[J];廣東藥學院學報;2007年01期

2 黃莛庭;;急性胰腺炎細胞內(nèi)早期事件的再認識[J];中華肝膽外科雜志;2006年02期

本文編號：2851106