目地:microRNA是一類含22-28個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)過(guò)程,參與了許多生理病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。肝卵圓細(xì)胞(Hepatic ovalcell,HOC)是肝臟的原始兼性多能干細(xì)胞,主要分布于肝臟小葉間膽管或Hering管,即終末膽管區(qū)域。肝卵圓細(xì)胞具備極強(qiáng)的體外自我復(fù)制、克隆增殖及分化能力,在肝臟嚴(yán)重?fù)p傷或者成熟肝細(xì)胞增殖受到抑制的時(shí)候,肝再生則主要通過(guò)卵圓細(xì)胞的增殖與分化來(lái)完成。本研究的目的是探討miR-21在肝卵圓細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及機(jī)制。方法:用慢病毒分別轉(zhuǎn)染大鼠肝卵圓細(xì)胞使miR-21的表達(dá)增強(qiáng)和抑制,用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率和PCR檢測(cè)三組miR-21表達(dá)情況(空載體組,miR-21增強(qiáng)組,miR-21抑制組),提取轉(zhuǎn)染后的肝卵圓細(xì)胞中的蛋白,用Western blotting方法檢測(cè)三組Smad7蛋白的表達(dá)情況,PCR檢測(cè)三組Smad7 mRNA的表達(dá)情況。用cck-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三組肝卵圓細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染肝卵圓細(xì)胞后篩選出了穩(wěn)定的細(xì)胞株,PCR結(jié)果示miR-21增強(qiáng)組其miR-21表達(dá)增強(qiáng),miR-21抑制組其miR-21表達(dá)抑制。Western blotting顯示miR-21增強(qiáng)組其Smad7蛋白的表達(dá)減少,miR-21抑制組其Smad7蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。PCR結(jié)果示Smad7mRNA的趨勢(shì)和miR-21表達(dá)趨勢(shì)相一致。結(jié)論:過(guò)表達(dá)miR-21通過(guò)Smad7促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞增殖過(guò)程。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖２?：?ｃｏｎｔｒｏｌ：空載體慢病毒轉(zhuǎn)染的ＨＯＣ?ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１?：?ｍｉＲ－２１增強(qiáng)載體??ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：?ｍｉＲ－２１－抑制慢病毒載體

?３．３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ檢測(cè)三組Ｓｍａｄ７蛋白的表達(dá)??Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ觀察到，如圖３所示，相對(duì)于空載體對(duì)照細(xì)胞，ｍｉＲ－２１增強(qiáng)??慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組其Ｓｍａｄ７蛋白的表達(dá)減少，ｍｉＲ－２１抑制慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組??其Ｓｍａｄ７蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。３Ａ：?Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ顯示三組Ｓｍａｄ７蛋白顯影情況。３Ｂ：??三組Ｓｍａｄ７蛋白表達(dá)柱狀圖。??老ｓ?！??ｉ?／?Ｉ??Ａ?■??Ｓｍａｄ７??ＧＡＰＤＨ??Ｂ?，??）Ｗｌ??ｚ?／?／??／?／?／??圖３：?ｓｃｒａｍｂｌｅ：空載體慢病毒轉(zhuǎn)染的ＨＯＣ?ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１：?ｍｉＲ－２１增強(qiáng)慢病毒轉(zhuǎn)染??的?ＨＯＣ?ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１：?ｍｉＲ－２１－抑制慢病毒轉(zhuǎn)染的?ＨＯＣ。（＊：尸＜０．０５）??３．４?ＰＣＲ檢測(cè)Ｓｍａｄ７?ｍＲＮＡ的表達(dá)??采用２－ＡＡＣＴ法計(jì)算出不同組中Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)量，如圖４Ａ所示：??ｐｒｅ－ｍｉＲ－２１?組其?Ｓｍａｄ７?ｍＲＮＡ?的表達(dá)增強(qiáng)，ａｎｔｉ－ｍｉＲ－２１?組其?Ｓｍａｄ７?ｍＲＮＡ?的表達(dá)??降低（與ｍｉＲ－２１的表達(dá)圖趨勢(shì)一致）。??１９??

３．５?ＣＣＫ－８檢測(cè)三組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的表迗??三組細(xì)胞在２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ，?９６ｈ培養(yǎng)后用ＣＣＫ－８試劑檢測(cè)４５０ｎｍ的吸收波，結(jié)??果如圖４Ｂ表明ｍｉＲ－２１增強(qiáng)組細(xì)胞增殖數(shù)量多于ｍｉＲ－２１抑制組的細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明??ｍｉＲ－２１過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)肝卵圓細(xì)胞的增殖。??２０??
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本文編號(hào)：2851118