研究背景與目的: 炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎性病變,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's Disease,CD),是胃腸道最為嚴重的疾病之一。該病常突發(fā)起病,多數(shù)病程緩慢,有反復(fù)發(fā)作的傾向,少數(shù)病例呈急性暴發(fā),病情兇險,病程較長者亦被認為結(jié)腸癌的癌前病變,世界衛(wèi)生組織將其列為難治性疾病之一。該病在我國發(fā)病率比較低,但近年來有大幅增加的趨勢。目前認為IBD的發(fā)病機制為:環(huán)境因素作用于遺傳易感者,在腸道菌叢的參與下,啟動了腸道免疫及非免疫系統(tǒng),最終導(dǎo)致免疫反應(yīng)和炎癥過程。但是始終未找到一種特定微生物和IBD恒定相關(guān)。 Syndecans是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,包含有硫酸乙酰肝素(HS)及硫酸軟骨素鏈修飾的Ⅰ型跨膜核心蛋白。硫酸乙酰肝素鏈能與許多對血管修復(fù)、血管發(fā)生及免疫細胞生長及細胞.細胞、細胞-細胞外基質(zhì)間黏附起調(diào)節(jié)作用的配體如許多生長因子、細胞因子、趨化因子和細胞外基質(zhì)等相互作用。Syndecans主要包括四個成員,其中Syndecan-1(CD138)是上皮細胞包括血管內(nèi)皮細胞的主要Syndecans成員。Syndecan-1攜帶的HS側(cè)鏈可結(jié)合一系列配體如細胞粘附分子、細胞外基質(zhì)成份、生長因子及細胞因子等,以共受體方式調(diào)節(jié)細胞與細胞、細胞與微環(huán)境之間的相互作用,參與細胞粘附、組織分化、血管形成及宿主防御等諸多生理病理過程的調(diào)節(jié)。 關(guān)于Syndecan-1和腫瘤關(guān)系研究比較多,但是在炎癥方面卻是近幾年才開始受到重視,國內(nèi)罕見報道。Syndecan-1胞外段可在脫落酶(sheddase)作用下從細胞表面水解脫落形成可溶性效應(yīng)分子并被吸收入血。Syndecan-1的胞外段HS鏈,是其主要功能部位,能與炎癥過程中的眾多的粘附分子、細胞外基質(zhì)成分、細胞因子、趨化因子等結(jié)合,在炎細胞的滾動、貼壁、黏附、游出等步驟中發(fā)揮作用,因此可認為,Syndecan-1與炎癥過程關(guān)系密切。在Syndecan-1基因敲除(Sdcl-/-)小鼠中,生長及發(fā)育均無異常。但是在綠膿桿菌的攻擊下,Sdcl-/-小鼠明顯耐受感染,表現(xiàn)出顯著下降的細菌定植力及明顯減輕的肺部炎癥和死亡率,說明Syndecan-1促進了感染性炎癥的發(fā)生。Syndecan-1還參與細胞-細胞外基質(zhì)的粘附。介導(dǎo)細胞粘附到胞外基質(zhì)蛋白的主要受體為整臺素家族受體,但胞外基質(zhì)蛋白還具有結(jié)合糖胺聚糖的能力,尤其是硫酸乙酰肝素。細胞能利用整合素和Syndecan-1雙受體來介導(dǎo)細胞-細胞外基質(zhì)的粘附。 而在炎癥的研究中,國外就肺炎與Syndecan-1的關(guān)系研究較多。在肺炎中,已證實MMP-7可導(dǎo)致Syndecan-1的脫落,形成的可溶性Syndecan-1與中性粒細胞趨化因子KC結(jié)合,動員KC形成趨化梯度,吸引中性粒細胞,促進肺炎的發(fā)生。但是關(guān)于Syndecan-1和腸炎之間的關(guān)系罕有報道。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Syndecan-1在IBD模型小鼠腸上皮細胞表面的表達明顯減低,而血清中游離Syndecan-1明顯增加,提示IBD與Syndecan-1脫落增加相關(guān)。有研究提示Syndecan-1表達缺失或破壞時可造成腸上皮屏障功能受損,導(dǎo)致蛋白丟失,分泌性腹瀉及營養(yǎng)障礙等,而在IBD患者的再生粘膜中也存在Syndecan-1的表達缺失,從而影響?zhàn)つさ挠�。另�?Syndecan-1似乎也和各種細胞因子有相互作用。Day RM等證實促炎因子TNF-α,IL-1β對腸上皮細胞中Syndecan-1的表達起下調(diào)作用,可能機制為通過使Syndecan-1的外功能區(qū)的脫落增加而引起腸道的炎癥反應(yīng)。 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細胞壁主要成分,也稱為內(nèi)毒素,在感染和炎癥中起著至關(guān)重要的作用。鑒于Syndecan-1與炎癥及感染關(guān)系密切,而腸道非特異性炎癥亦和感染有重要關(guān)系。基于以上背景,我們推測,腸道細菌可能通過影響Syndecan-1的表達來參與腸道非特異性炎癥的過程。因此我們通過與細菌感染密切相關(guān)的促炎因素TNF-α和LPS刺激腸上皮細胞,觀察不同劑量刺激物對Syndecan-1表達的影響,為Syndecan-1在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供重要線索,研究內(nèi)容包括: 1、Syndecan-1在不同疾病患者腸粘膜組織及不同腸上皮細胞系中的表達 2、不同劑量TNF-α刺激下Syndecan-1在腸上皮細胞的表達變化 3、不同劑量LPS作用下腸上皮細胞及細胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1的變化 4、不同劑量LPS刺激下腸上皮細胞粘附力的改變。 方法 1、免疫組化法檢測IBD、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸腺癌患者腸粘膜組織中Syndecan-1的表達。 2、流式細胞儀分析不同腸上皮細胞株,篩選出Syndecan-1表達量高的SW480細胞用于后續(xù)實驗。 3、免疫熒光染色法檢測不同劑量TNF-α刺激SW480細胞后,Syndecan-1表達變化。 4、免疫熒光染色法檢測不同劑量LPS作用SW480后Syndecan-1表達變化。 5、Dot-blot檢測各組細胞和培養(yǎng)上清Syndecan-1蛋白水平的變化。 6、細胞計數(shù)法檢測不同組粘附力改變。 7、統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以(?)±S表示,進行單向方差分析;Dot-blot結(jié)果進行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗;P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1、Syndecan-1在腸粘膜組織中的表達:在不同疾病腸粘膜組織中,Syndecan-1表達有明顯差異。在IBD患者腸粘膜組織中,上皮細胞表面表達減少,間質(zhì)表達增多,血清中游離Syndecan-1水平明顯升高。而在低分化腺癌中,Syndecan-1表達呈缺失狀態(tài)。 2、Syndecan-1在不同腸上皮細胞的表達:SW480細胞高表達Syndecan-1分子,HT-29細胞表達少量Syndecan-1分子,Lovo細胞基本不表達Syndecan-1分子。 3、不同濃度TNF-α作用下SW480細胞表達Syndecan-1的趨勢變化:隨著TNF-α濃度增加,Syendecan-1的表達熒光強度由強漸弱。TNF-α對Syndecan-1表達呈劑量依賴性。各組間F=73.498,P=0.000,差異有顯著性意義。進一步做多重比較對照組(0ng/ml組)和2.5ng/ml組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義,(P=1.000),而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。 4、不同濃度LPS作用下SW480表達Syndecan-1的趨勢變化:在未加LPS組(即0ng/ml組),可見Syndecan-1膜表達明顯,隨著濃度增加,熒光減弱,到10~4ng/ml組,熒光幾乎不能檢測,可見LPS對Syndecan-1表達的影響呈劑量依賴性。各組間F=106.300,P=0.000,差異有顯著性意義。進一步做多重比較10~3ng/ml組和10~4ng/ml組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義,(P=0.066),而其他的各組間差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。0ng/ml組vs10ng/ml組,P=0.003;0ng/ml組vs其他組,P=0.000。 5、不同濃度LPS作用下腸上皮細胞Syndecan-1脫落的變化:隨LPS濃度增加,細胞培養(yǎng)上清中Syndecan-1蛋白呈逐漸增多趨勢,處理組IOD比值高于對照組,各組間差異有顯著性意義,χ~2=12.321,v=4,P=0.015。10~4ng/ml組上清中蛋白表達量最高,10~3ng/ml組和10~2ng/ml組次之。 6、不同濃度LPS作用后腸上皮細胞同質(zhì)粘附力改變:隨著LPS劑量的遞增,細胞與細胞之間粘附力下降。各組間F=264.364,P=0.000,差異有顯著性意義,進一步做多重比較。對照組(即未加LPS組)和10ng/ml組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義,(P=0.984),而與其他的各組差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000) 結(jié)論 1、在IBD患者的腸粘膜組織中,Syndecan-1蛋白在膜表達較正常減低,而間質(zhì)表達增多,血清中游離Syndecan-1較正常對照組明顯增多,表明Syndecan-1脫落增加與IBD發(fā)生相關(guān)。 2、促炎因子TNF-α和細菌內(nèi)毒素LPS對腸上皮細胞Syndecan-1表達呈劑量依賴性,隨著TNF-α和LPS濃度增高,腸上皮細胞表面Syndecan-1表達減少,而腸上皮細胞培養(yǎng)上清中游離Syndecan-1逐漸增加,說明細菌感染和促炎因子可促進Syndecan-1的脫落。 3、LPS刺激后,腸上皮細胞粘附力亦隨之下降,并呈劑量依賴性。 4、腸道細菌和炎癥因子可能通過增強Syndecan-1的脫落而促進IBD的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R574.4
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 Syndecan-1在不同腸粘膜組織中表達變化及其意義
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第二章 TNF-α作用下腸上皮細胞 Syndecan-1表達變化
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第三章 脂多糖作用下腸上皮細胞Syndecan-1表達變化
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
英文縮略詞對照表
攻讀碩士學(xué)位期間成果
致謝
統(tǒng)計合格證明

【共引文獻】

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本文編號：2849900