乙肝病毒X蛋白對肝細(xì)胞凋亡的影響新型抗乙肝病毒化合物的篩選 乙肝病毒X蛋白(HBV X protein, HBx)與乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)相關(guān)肝癌(HCC)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。深入研究HBx在HCC形成中的作用將為探索HBV致癌機(jī)制提供重要依據(jù)。HBx為多功能蛋白,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多條信號傳導(dǎo)途徑,從而調(diào)控許多細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄；HBx還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡,促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 許多文獻(xiàn)表明HBx既具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡又具有抑制細(xì)胞凋亡的功能,原因還不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HBx對Huh7肝細(xì)胞凋亡的影響存在劑量依賴性,在低劑量轉(zhuǎn)染HBx表達(dá)質(zhì)粒時,HBx抑制細(xì)胞凋亡,而當(dāng)HBx表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量達(dá)到較高水平時,HBx反而會促進(jìn)細(xì)胞凋亡。近期Clippinger等發(fā)現(xiàn)在同一細(xì)胞株中HBx即可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡又可以抑制細(xì)胞凋亡,決定因素在于NF-kB的活性狀態(tài)。我們的研究初步發(fā)現(xiàn)HBx隨著表達(dá)量的不同可以影響NF-κB的細(xì)胞定位。 全球約有3億5千萬人被HBV慢性感染,其中10-15%的慢性肝炎忠者最終可能發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌。目前慢性乙肝的治療藥物主要有兩大類,核苷(酸)類似物和干擾素。現(xiàn)有藥物存在的主要問題是核苷(酸)類似物長期使用會誘導(dǎo)病毒耐藥株的出現(xiàn)；而干擾素應(yīng)答率低且副作用大,因此迫切需要研發(fā)新型抗HBV藥物。 金絲桃(Hypericum chinense L.)是金絲桃科金絲桃屬植物。文獻(xiàn)研究曾發(fā)現(xiàn)金絲桃具有抗菌抗病毒的活性。本部分中,我們與復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院穆青課題組合作,在細(xì)胞水平上對金絲桃的各種分離提取物進(jìn)行了細(xì)胞毒性分析和抗HBV活性分析,初步篩選出了單體HCF2-4-2-5,其對HBV DNA復(fù)制、HBsAg和HBeAg蛋白的表達(dá)水平均有一定的抑制作用,為進(jìn)一步研究提供了先導(dǎo)化合物。 第一部分HBx蛋白對Huh7肝細(xì)胞凋亡的影響 目的驗證HBx蛋白的不同表達(dá)劑量對Huh7肝細(xì)胞的凋亡是否存在不同的影響。 方法構(gòu)建HBx表達(dá)質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將不同量的HBx表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入Huh7肝細(xì)胞和293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行凋亡相關(guān)的檢測,包括FITC-Annexin V流式細(xì)胞檢測,Caspase 3蛋白酶的降解體的檢測,線粒體及胞漿內(nèi)Cytochrome C的檢測等,以確定細(xì)胞凋亡的變化情況與HBx的表達(dá)量是否存在規(guī)律性的關(guān)聯(lián)。通過免疫熒光共聚焦方法對HBx和NF-kB的細(xì)胞內(nèi)定位進(jìn)行了初步探索。 結(jié)果HBx的不同表達(dá)量可對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生不同的影響。對于1×106個細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染較低量的HBx表達(dá)質(zhì)粒(0.25μg、0.5μg)時,可以一定程度的抑制凋亡作用；而當(dāng)HBx表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量提高到1μg以上時,細(xì)胞凋亡反而愈發(fā)明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不同量的HBx在細(xì)胞內(nèi)的定位不同,而NF-kB隨之在細(xì)胞內(nèi)的定位也不同,為研究不同劑量HBx對細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制提供了初步的線索。 結(jié)論HBx在低表達(dá)量時可以抑制細(xì)胞凋亡,而高表達(dá)量時反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 第二部分新型抗HBV化合物的篩選 目的從金絲桃植物中提取分離一系列粗產(chǎn)物及化合物單體進(jìn)行抗HBV活性的篩選,以期獲得具有抗HBV活性的先導(dǎo)化合物。 方法培養(yǎng)HBV穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞(HepG2.2.15),將不同稀釋度的化合物分別加入培養(yǎng)基中,4天后通過CCK-8法檢測藥物的細(xì)胞毒性,確定合適(存活率90%以上)的用藥濃度�？共《净钚院Y選中,加藥4天后分別用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中HBsAg、HBeAg表達(dá)量及應(yīng)用Real-time PCR法檢測上清中及胞內(nèi)HBV DNA的含量。 結(jié)果從金絲桃中提取的單體化合物HCF2-4-2-5可明顯減少HepG2.2.15細(xì)胞上清中的HBV DNA含量。 結(jié)論HCF2-4-2-5具有一定的抗HBV活性,為在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62;R735.7
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 HBx調(diào)節(jié)Huh7細(xì)胞凋亡作用的研究
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
第二部分 新型抗HBV化合物的篩選
    引言
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
參考文獻(xiàn)
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 項光亞,周宜開;化學(xué)發(fā)光法檢測金絲桃對DNA損傷的保護(hù)作用[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2000年03期

2 項光亞,楊瑜,阮金蘭,周宜開;金絲桃化學(xué)成分研究[J];同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年05期

本文編號：2849444