發(fā)布時間：2020-10-17 19:22

　　 研究背景與目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為威脅人類健康的一種嚴重的慢性肝病,據(jù)報導,約25%的NAFLD患者會發(fā)展成為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。目前,對NASH的藥物治療手段有限,因此,探明NASH的發(fā)病機制,在疾病的源頭阻止疾病進一步進展尤為重要。NASH的一個重要特點就是炎癥細胞的浸潤,其中巨噬細胞被認為是抵抗肝損傷的第一道屏障。因此,探明肝臟巨噬細胞在NASH發(fā)病中的作用及功能演變尤為重要。目前,對NASH進展過程中巨噬細胞表型的動態(tài)變化及機制仍不清楚,因此,本研究旨在探究小鼠肝臟巨噬細胞在NASH進展過程中的表型及功能的動態(tài)變化,并探討游離脂肪酸通過T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(Tcell Immunoglobulin domain and Mucindomainprotein-3,Tim-3)對巨噬細胞分型的影響,為NASH的早期診斷及治療提供新的思路。研究方法1、第一部分:動態(tài)研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型進展過程中肝臟巨噬細胞的募集及分型變化采用MCD飼喂小鼠制備小鼠NASH模型,并于飼喂的第1、2、3、4周分別處死動物,采集小鼠外周血及肝組織,對肝臟進行HE染色以觀察小鼠肝臟的冰露改變,同時分離小鼠血清檢測肝功能及炎癥因子的變化。分離小鼠肝臟單個核細胞,通過流式細胞術(shù)檢測CD11b+F4/80+及CD206+F4/80+巨噬細胞的動態(tài)變化,并通過q-PCR檢測肝臟巨噬細胞中Arg-1,FIZZ及iNOS的表達變化。2、脂肪酸引起巨噬細胞分型變化的機制研究采用MCD飼喂小鼠制備小鼠NASH模型,并于飼喂的第1、2、3、4周分別處死動物,分離小鼠肝臟單個核細胞,流式細胞術(shù)檢測Tim-3+F4/80+巨噬細胞的動態(tài)變化。游離脂肪酸(FFA)刺激THP-1、Raw264.7、人外周血單核細胞細胞后,流式檢測Tim-3及M1型分子HLA-DR的變化;FFA刺激過表達Tim-3的THP-1細胞后檢測HLA-DR的變化;FFA處理M-CSF誘導的M2型巨噬細胞后,檢測M2型分子CD206的變化。研究結(jié)果1、動態(tài)研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型進展過程中肝臟巨噬細胞的募集及分型變化(1)在NASH進展過程中,小鼠肝臟F4/80+細胞在肝臟單個核細胞中的比例增加;(2)小鼠NASH進展過程中,肝臟募集外周CD11b+的巨噬細胞增加,并持續(xù)維持在高水平;(3)在NASH形成早期,小鼠肝臟M2型巨噬細胞增加,之后隨著疾病進展逐漸減少;(4)隨著NASH進展,小鼠血清TNF-α水平逐漸升高,而IL-10在疾病早期明顯升高,之后隨著疾病進展逐漸降低。2、脂肪酸引起巨噬細胞分型變化的機制研究(1)在NASH進展過程中,小鼠肝臟巨噬細胞表面Tim-3升高,之后隨著疾病進展逐漸降低;(2)游離脂肪酸能抑制巨噬細胞Tim-3的表達,并促進巨噬細胞向M1型極化;(3)游離脂肪酸對過表達Tim-3的巨噬細胞的活化作用減弱;(4)游離脂肪酸可使以分化為M2型的巨噬細胞向M1型極化。研究結(jié)論1、隨著NASH疾病進展,小鼠肝臟募集外周單核/巨噬細胞增多并表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài):在疾病早期M2型巨噬細胞增加,并隨著疾病進展逐漸減少;2、游離脂肪酸通過抑制巨噬細胞Tim-3的表達,促進巨噬細胞向M1型極化。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

１．３．９統(tǒng)計分析??實驗數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ?１７．０?ｆｏｒ?Ｗｉｎｄｏｗｓ分析，數(shù)據(jù)用Ｍｅａｎ±ＳＤ表示，兩組間??數(shù)據(jù)比較采用Ｔ－ｔｅｓｔ檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用ＡＮＯＶＡ評價組間的差異性，每個??體外實驗至少重復３次，Ｐ＜０．０５認為差異具有顯著性。??１．４實驗結(jié)果??１．４．１?ＭＣＤ制備小鼠ＮＡＳＨ模型??ＭＣＤ飼喂后，小鼠較正常飲食組體重減輕（圖１）。ＭＣＤ飼喂一周后肝細胞??內(nèi)即出現(xiàn)脂肪變，肝細胞體積叫正常組增大，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡；飼喂２－３周時，??肝細胞內(nèi)脂肪空泡增多，并出現(xiàn)氣球變性，少許炎癥細胞浸潤；第４周時，肝小??葉內(nèi)炎癥細胞浸潤增多，并逐漸出現(xiàn)肝纖維化的表現(xiàn)。（圖２）與正常飲食組相比，??模型組小鼠ＡＬＴ／ＡＳＴ均升高，在第２周出現(xiàn)明顯升高并維持在較高水平。??Ａ?Ｂ??＾?ＮＣＤ

浙江大學博士學位論文?第一部分動態(tài)研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型進展過程???中肝臟巨噬細胞的募集及分型變化??變化；圖Ｂ：小鼠肝內(nèi)甘油三醋含量變化??．

圖３ＭＣＤ飲食飼喂小鼠肝功能情況。Ａ：?ＡＬＴ變化情況；Ｂ：?ＡＳＴ變化情＊：?Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０＿０１??１．４．２小鼠肝內(nèi)巨噬細胞在ＮＡＳＨ進展過程中含量變化??為了了解ＮＡＳＨ進展過程中小鼠肝內(nèi)巨噬細胞含量的變化，每周分離正常及模型組小鼠肝臟單個核細胞，利用流式細胞術(shù)檢測小鼠肝臟單個核細胞內(nèi)Ｆ４／陽性的巨噬細胞的比例。如圖４所示：ＭＣＤ飼喂一周后，小鼠肝內(nèi)巨噬細胞單個核細胞比例（１９．２４±１．８５％）較正常組（８．５９±２．３８％）增多（Ｐ＝０．０３３），并１４??
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本文編號：2845221