背景 原發(fā)性膽汁性肝硬化，是由免疫紊亂介導的慢性進行性非化膿性膽管炎性疾病，可引發(fā)肝內中小膽管的損傷和肝內膽汁淤積，病理表現(xiàn)為膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實質碎屑狀壞死，最終可進展為肝硬化[1]。近年來，隨著環(huán)境污染的加重、生活方式的日益西化，以及醫(yī)生對該病認知程度的提高，PBC在我國的檢出率逐年升高。目前認為，PBC是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下，經(jīng)由免疫反應介導的一種自身免疫性疾病。許多報道顯示，PBC發(fā)病具有明顯的家族聚集現(xiàn)象;雙胞胎發(fā)病率顯著增高; PBC一級親屬發(fā)病率比正常人發(fā)病率高100倍[2,3]。這些都提示，遺傳因素在PBC的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。國外對PBC的基因易感位點進行了大量的研究[4]。通過文獻分析，高加索人和亞洲人的PBC相關SNP位點存在著明顯差異。這些基因的不用位點或不同位點的單倍型均不同程度的顯示與PBC易感性有關。大量文獻顯示，東西方人群對比顯示不同種族或民族的基因多態(tài)性存在很大差異，提示歐美結果不能反映中國人的情況，又因為目前國內這方面的研究較少，所以本研究通過研究候選基因多態(tài)性進行中國人PBC相關基因易感多態(tài)性研究。 目的 篩選中國人群中PBC基因易感位點，從影響人群膽汁分泌與排泄功能、小膽管損傷、免疫紊亂等方面，探討基因多態(tài)性對PBC遺傳易感性的影響。 方法 通過大量文獻回顧查閱已經(jīng)報道的東西方人群中與自身免疫性疾病相關的SNP位點及基因，并根據(jù)當前研究的與免疫性疾病相關SNPs，分析已發(fā)現(xiàn)的一些可能與PBC發(fā)病相關SNPs位點，最終確定本課題將要篩選的基因。收集PBC患者及對照全血，用SNP芯片檢測易感基因位點，通過質譜分析得出基因分型結果并結合疾病相關臨床指標等對其進行多層統(tǒng)計學分析。 結果 （1）根據(jù)目前已經(jīng)報道的與原發(fā)性膽汁性肝硬化以及與自身免疫性疾病和肝臟疾病相關的基因SNPs。針對參與免疫調節(jié)、膽汁排泄、膽管上皮損傷機制的19個基因中的49個SNPs設計引物并合成芯片。其中參與T細胞增殖、陽性選擇的分子包括PTPN22、CTLT-4及HLA類分子。參與Th1細胞分化的分子包括IL-12、IRF5、STAT4、IFN-γ及Tyk2等分子。參與膽汁合成、轉運及排泄的分子包括MDR1、MDR3、BSEP、MRP2、CYP、AE2等。 （2）2004年7月到2011年8月共入組448例樣本：PBC患者（134例），對照（314例）。 （3）經(jīng)病例-對照分析基因型頻率分布，定位于BSEP基因的rs473351，兩組具有顯著性差異（P=0.004）。定位于STAT4基因的rs6748358，兩組具有顯著性差異（P=0.009）。定位于PTPN22基因的rs738409，兩組具有顯著性差異（P=0.020）。其余各點的基因型頻率分布均無顯著性差異。 （4）經(jīng)顯性模型、隱性模型以及共顯性遺傳模型分析，BSEP基因的位點rs473351與PBC的易感性有關，其突變堿基A（dominant model: OR,2.063；95%CI,1.254-3.393; P=0.004）與PBC的易感性具高度相關性。位點rs2287618與PBC的易感性有關，其突變堿基A（dominant model, OR,0.617;95%CI，0.411-0.928; P=0.020）與PBC的易感性具高度相關性。STAT4rs6748358與PBC的易感性有關，其突變堿基A（dominant model, OR,1.567;95%CI，1.044-2.353; P=0.030）與PBC的易感性具高度相關性。 （5）BSEP中rs473351與rs2287618具有高度連鎖性LD (D’0.9)它們與定位在BSEP的其他兩個位點不存在連鎖關系。多因子降解法分析顯示：基因STAT4-PNPLA3位點rs738409、rs2235048、 rs2280714、 rs10181656次要位點組合的攜帶者，患病危險率顯著高于其他人�；駼SEP-STAT4位點rs280519、rs473351、rs2280714、rs2461823、rs10181656次要位點組合的攜帶者，患病危險率顯著高于其他人。 （6）本研究納入臨床資料收集完整的PBC患者（96例），對BSEP基因多態(tài)性及臨床指標（ALP、GGT、TBIL）相關性進行Logistic回歸分析，結果顯示，攜帶rs2287618次要等位基因的個體與ALP值呈正相關（P 0.05）。同時，攜帶rs2287618次要等位基因的個體對UDCA的應答水平降低，具有統(tǒng)計學意義。 （7）對PBC相關抗體與BSEP基因多態(tài)性進行分析，結果顯示，AMA陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，二者具有顯著性差異。同時，Sp100抗體陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，具有統(tǒng)計學意義。而BPO、gp210等抗體陽性率與攜帶此位點次要等位基因頻率比較，二者無顯著性差異。主要細胞因子，我們對21例PBC患者和21例對照進行了Wilcoxon秩和檢驗分析。IL-4、IL-10的表達水平在病例組和對照組具有顯著差異（P值分別為0.04，0.033）；IL-2、IL-12、IL-17檢測結果顯示，PBC組與對照組無顯著性差異（P值分別為0.24，0.12，0.07）。進一步進行BSEP基因多態(tài)性與IL-4、IL-10表達水平的邏輯回歸分析，結果沒有顯著差異。 結論 （1）從遺傳易感性角度篩選到了PBC相關SNPs：rs473351、rs2287618、rs6748358、rs738409等，首次發(fā)現(xiàn)基因BSEP位點rs473351，STAT4位點rs6748358，PTPN22位點rs738409的基因型分布在中國PBC患者中存在顯著性差異；等位基因同樣存在顯著性差異；說明這些位點多態(tài)性可能與PBC的發(fā)病機制有關。 （2）首次對BSEP的基因多態(tài)性與PBC易感性關系的深入研究。遺傳模型證實突變BSEP可能是參與PBC發(fā)病的候選分子。模型分析顯示為BSEP基因位點rs473351、位點rs2287618，STAT4基因位點rs6748358，攜帶A等位基因的人群患PBC的風險明顯增高。而rs473351的突變型致病性更強。由此可以看出，BSEP可能在PBC的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。 （3）BSEP基因的rs473351、rs2287618存在緊密連鎖。進一步對其進行單倍型分析，結果顯示單倍體AA（均為次要等位基因）顯著降低了PBC的發(fā)病率。相反,如果患者出現(xiàn)GG單倍型，則其發(fā)病率顯著增高。說明其對PBC的發(fā)病可能起到了不可忽視的作用。進行MDR分析后，同時攜帶分別定位于BSEP、STAT4基因的次要等位基因位點組合的人群患PBC的概率顯著增高。同樣，攜帶STAT4、PNPLA3基因的次要等位基因位點組合的人群發(fā)生PBC的概率顯著高于其他人。這提示我們要對基因BSEP、STAT4以及其在免疫性疾病中的連鎖關系高度關注。 （4）ALP、GGT、TBIL是評估病情、判斷預后的重要指標。首次對BSEP基因多態(tài)性與PBC相關臨床指標進行邏輯回歸分析，結果顯示BSEPrs2287618與ALP具有相關性，提示BSEP rs2287618可能是PBC的獨立危險因素。一致率檢驗顯示，判別UDCA應答的兩種標準（Barcelona標準和PairsⅠ標準）具有良好的一致性。首次進行BSEP基因多態(tài)性與UDCA應答率（采用Barcelona標準）的邏輯回歸分析，攜帶rs2287618次要等位基因的個體對UDCA的應答水平降低。這些都提示：BSEP rs2287618具有重要的研究意義。 （5）首次對BSEP基因多態(tài)性與PBC相關免疫指標AMA、BPO、Sp100、gp210進行邏輯回歸分析，抗體AMA陽性率和Sp100陽性率在基因BSEPrs2287618突變的群體中顯著增高。 （6）肝臟病變部位浸潤的淋巴細胞主要為CD4細胞，可能以Th1細胞為主。本實驗首次進行了BSEP基因多態(tài)性與IL-4、IL-10表達水平的邏輯回歸分析，結果沒有顯著性差異，這可能是由于入組樣本量小造成的。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學碩士學位論文文獻回顧、原發(fā)性膽汁性肝硬化概述原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC），是一種慢性進行膽汁淤積性肝臟疾病，其病因不明確, 以肝內小膽管損傷為主的慢性非化性炎癥為特征，表現(xiàn)為伴膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實質碎屑狀壞死，最可有肝炎進展為肝硬化[1]。如下圖所示：

第四軍醫(yī)大學碩士學位論文表達小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，膽汁流以及膽鹽、卵磷脂、膽固醇的膽汁分泌都相應增加。然而，BSEP 基因敲除小鼠中，膽汁膽鹽輸出量明顯減少，血漿和肝臟膽汁酸濃度上升。以上實驗表明，BSEP 對膽汁酸鹽的正常分泌起十分重要的作用。BSEP，即膽鹽輸出泵,主要存在于肝臟中,位于肝細胞的毛細膽管面，它由 1321 個氨基酸組成，分子量約 160kDa。屬于 ABC 轉運蛋白家族成員，人類 ABCB11 基因可編碼產(chǎn)生膽鹽輸出泵(BSEP)。如同其他 ABC 超家族全長轉運體一樣，推測它的拓撲結構是一個緊密銜接的復寫結構，每一半都由六個預測的跨膜結構域組成[57]（圖 2）。

圖 3 BSEP 作用機制BSEP 的表達與功能受多種水平調控。ABCB11 基因啟動子區(qū)含有反轉順序 IR-1，為法尼酯衍生物 x 受體(FarnesoidXreceptor，F(xiàn)XR)的結合位許多研究已證實在膽酸的激活下，F(xiàn)XR/RXR 異二聚體與 BSEP 啟動子 IR-1 結合來調節(jié)基因的轉錄[58]。翻譯后，BSEP 蛋白還要經(jīng)過糖基化化、泛素化等修飾。蛋白質糖基化對于正確折疊和新合成蛋白質的穩(wěn)定至關重要，并且對蛋白質的載荷和溶解度也有很大影響；大鼠 BSEP 的個胞外環(huán)含有 4 個 N-糖基化的天冬酰胺殘基，人類 BSEP 的天冬酰胺殘存在糖基化位點。磷酸化作用可以影響 BSEP 定位的轉譯后修正作用等磷酸化酶可通過激活 p38MAPKs 途徑使 BSEP 從高爾基復合體轉移管側膜[59]。泛素化介導的錯誤折疊、截斷導致的 BSEP 蛋白降解可能在 表面表達調控中發(fā)揮重要作用。最近的研究采用免疫沉淀法顯示 BSE鏈泛素相關聯(lián)，泛素化的 BSEP 半衰期縮短。表達后的 BSEP 蛋白還可
【參考文獻】

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1 劉炬;徐兵河;;單核苷酸多態(tài)與乳腺癌患者的預后[J];癌癥進展;2007年03期

2 ;Analysis of HLA alleles polymorphism in Chinese patients with primary biliary cirrhosis[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2006年01期

本文編號：2845191