背景 原發(fā)性膽汁性肝硬化，是由免疫紊亂介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性非化膿性膽管炎性疾病，可引發(fā)肝內(nèi)中小膽管的損傷和肝內(nèi)膽汁淤積，病理表現(xiàn)為膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實(shí)質(zhì)碎屑狀壞死，最終可進(jìn)展為肝硬化[1]。近年來，隨著環(huán)境污染的加重、生活方式的日益西化，以及醫(yī)生對該病認(rèn)知程度的提高，PBC在我國的檢出率逐年升高。目前認(rèn)為，PBC是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下，經(jīng)由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病。許多報(bào)道顯示，PBC發(fā)病具有明顯的家族聚集現(xiàn)象;雙胞胎發(fā)病率顯著增高; PBC一級親屬發(fā)病率比正常人發(fā)病率高100倍[2,3]。這些都提示，遺傳因素在PBC的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。國外對PBC的基因易感位點(diǎn)進(jìn)行了大量的研究[4]。通過文獻(xiàn)分析，高加索人和亞洲人的PBC相關(guān)SNP位點(diǎn)存在著明顯差異。這些基因的不用位點(diǎn)或不同位點(diǎn)的單倍型均不同程度的顯示與PBC易感性有關(guān)。大量文獻(xiàn)顯示，東西方人群對比顯示不同種族或民族的基因多態(tài)性存在很大差異，提示歐美結(jié)果不能反映中國人的情況，又因?yàn)槟壳皣鴥?nèi)這方面的研究較少，所以本研究通過研究候選基因多態(tài)性進(jìn)行中國人PBC相關(guān)基因易感多態(tài)性研究。 目的 篩選中國人群中PBC基因易感位點(diǎn)，從影響人群膽汁分泌與排泄功能、小膽管損傷、免疫紊亂等方面，探討基因多態(tài)性對PBC遺傳易感性的影響。 方法 通過大量文獻(xiàn)回顧查閱已經(jīng)報(bào)道的東西方人群中與自身免疫性疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)及基因，并根據(jù)當(dāng)前研究的與免疫性疾病相關(guān)SNPs，分析已發(fā)現(xiàn)的一些可能與PBC發(fā)病相關(guān)SNPs位點(diǎn)，最終確定本課題將要篩選的基因。收集PBC患者及對照全血，用SNP芯片檢測易感基因位點(diǎn)，通過質(zhì)譜分析得出基因分型結(jié)果并結(jié)合疾病相關(guān)臨床指標(biāo)等對其進(jìn)行多層統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 （1）根據(jù)目前已經(jīng)報(bào)道的與原發(fā)性膽汁性肝硬化以及與自身免疫性疾病和肝臟疾病相關(guān)的基因SNPs。針對參與免疫調(diào)節(jié)、膽汁排泄、膽管上皮損傷機(jī)制的19個(gè)基因中的49個(gè)SNPs設(shè)計(jì)引物并合成芯片。其中參與T細(xì)胞增殖、陽性選擇的分子包括PTPN22、CTLT-4及HLA類分子。參與Th1細(xì)胞分化的分子包括IL-12、IRF5、STAT4、IFN-γ及Tyk2等分子。參與膽汁合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及排泄的分子包括MDR1、MDR3、BSEP、MRP2、CYP、AE2等。 （2）2004年7月到2011年8月共入組448例樣本：PBC患者（134例），對照（314例）。 （3）經(jīng)病例-對照分析基因型頻率分布，定位于BSEP基因的rs473351，兩組具有顯著性差異（P=0.004）。定位于STAT4基因的rs6748358，兩組具有顯著性差異（P=0.009）。定位于PTPN22基因的rs738409，兩組具有顯著性差異（P=0.020）。其余各點(diǎn)的基因型頻率分布均無顯著性差異。 （4）經(jīng)顯性模型、隱性模型以及共顯性遺傳模型分析，BSEP基因的位點(diǎn)rs473351與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基A（dominant model: OR,2.063；95%CI,1.254-3.393; P=0.004）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。位點(diǎn)rs2287618與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基A（dominant model, OR,0.617;95%CI，0.411-0.928; P=0.020）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。STAT4rs6748358與PBC的易感性有關(guān)，其突變堿基A（dominant model, OR,1.567;95%CI，1.044-2.353; P=0.030）與PBC的易感性具高度相關(guān)性。 （5）BSEP中rs473351與rs2287618具有高度連鎖性LD (D’0.9)它們與定位在BSEP的其他兩個(gè)位點(diǎn)不存在連鎖關(guān)系。多因子降解法分析顯示：基因STAT4-PNPLA3位點(diǎn)rs738409、rs2235048、 rs2280714、 rs10181656次要位點(diǎn)組合的攜帶者，患病危險(xiǎn)率顯著高于其他人�；駼SEP-STAT4位點(diǎn)rs280519、rs473351、rs2280714、rs2461823、rs10181656次要位點(diǎn)組合的攜帶者，患病危險(xiǎn)率顯著高于其他人。 （6）本研究納入臨床資料收集完整的PBC患者（96例），對BSEP基因多態(tài)性及臨床指標(biāo)（ALP、GGT、TBIL）相關(guān)性進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體與ALP值呈正相關(guān)（P 0.05）。同時(shí)，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體對UDCA的應(yīng)答水平降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 （7）對PBC相關(guān)抗體與BSEP基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，AMA陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，二者具有顯著性差異。同時(shí)，Sp100抗體陽性人群攜帶rs2287618次要等位基因的頻率顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而BPO、gp210等抗體陽性率與攜帶此位點(diǎn)次要等位基因頻率比較，二者無顯著性差異。主要細(xì)胞因子，我們對21例PBC患者和21例對照進(jìn)行了Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析。IL-4、IL-10的表達(dá)水平在病例組和對照組具有顯著差異（P值分別為0.04，0.033）；IL-2、IL-12、IL-17檢測結(jié)果顯示，PBC組與對照組無顯著性差異（P值分別為0.24，0.12，0.07）。進(jìn)一步進(jìn)行BSEP基因多態(tài)性與IL-4、IL-10表達(dá)水平的邏輯回歸分析，結(jié)果沒有顯著差異。 結(jié)論 （1）從遺傳易感性角度篩選到了PBC相關(guān)SNPs：rs473351、rs2287618、rs6748358、rs738409等，首次發(fā)現(xiàn)基因BSEP位點(diǎn)rs473351，STAT4位點(diǎn)rs6748358，PTPN22位點(diǎn)rs738409的基因型分布在中國PBC患者中存在顯著性差異；等位基因同樣存在顯著性差異；說明這些位點(diǎn)多態(tài)性可能與PBC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。 （2）首次對BSEP的基因多態(tài)性與PBC易感性關(guān)系的深入研究。遺傳模型證實(shí)突變BSEP可能是參與PBC發(fā)病的候選分子。模型分析顯示為BSEP基因位點(diǎn)rs473351、位點(diǎn)rs2287618，STAT4基因位點(diǎn)rs6748358，攜帶A等位基因的人群患PBC的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。而rs473351的突變型致病性更強(qiáng)。由此可以看出，BSEP可能在PBC的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。 （3）BSEP基因的rs473351、rs2287618存在緊密連鎖。進(jìn)一步對其進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示單倍體AA（均為次要等位基因）顯著降低了PBC的發(fā)病率。相反,如果患者出現(xiàn)GG單倍型，則其發(fā)病率顯著增高。說明其對PBC的發(fā)病可能起到了不可忽視的作用。進(jìn)行MDR分析后，同時(shí)攜帶分別定位于BSEP、STAT4基因的次要等位基因位點(diǎn)組合的人群患PBC的概率顯著增高。同樣，攜帶STAT4、PNPLA3基因的次要等位基因位點(diǎn)組合的人群發(fā)生PBC的概率顯著高于其他人。這提示我們要對基因BSEP、STAT4以及其在免疫性疾病中的連鎖關(guān)系高度關(guān)注。 （4）ALP、GGT、TBIL是評估病情、判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。首次對BSEP基因多態(tài)性與PBC相關(guān)臨床指標(biāo)進(jìn)行邏輯回歸分析，結(jié)果顯示BSEPrs2287618與ALP具有相關(guān)性，提示BSEP rs2287618可能是PBC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一致率檢驗(yàn)顯示，判別UDCA應(yīng)答的兩種標(biāo)準(zhǔn)（Barcelona標(biāo)準(zhǔn)和PairsⅠ標(biāo)準(zhǔn)）具有良好的一致性。首次進(jìn)行BSEP基因多態(tài)性與UDCA應(yīng)答率（采用Barcelona標(biāo)準(zhǔn)）的邏輯回歸分析，攜帶rs2287618次要等位基因的個(gè)體對UDCA的應(yīng)答水平降低。這些都提示：BSEP rs2287618具有重要的研究意義。 （5）首次對BSEP基因多態(tài)性與PBC相關(guān)免疫指標(biāo)AMA、BPO、Sp100、gp210進(jìn)行邏輯回歸分析，抗體AMA陽性率和Sp100陽性率在基因BSEPrs2287618突變的群體中顯著增高。 （6）肝臟病變部位浸潤的淋巴細(xì)胞主要為CD4細(xì)胞，可能以Th1細(xì)胞為主。本實(shí)驗(yàn)首次進(jìn)行了BSEP基因多態(tài)性與IL-4、IL-10表達(dá)水平的邏輯回歸分析，結(jié)果沒有顯著性差異，這可能是由于入組樣本量小造成的。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：R575.2
【部分圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)回顧、原發(fā)性膽汁性肝硬化概述原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC），是一種慢性進(jìn)行膽汁淤積性肝臟疾病，其病因不明確, 以肝內(nèi)小膽管損傷為主的慢性非化性炎癥為特征，表現(xiàn)為伴膽管破壞、門脈區(qū)炎癥及肝實(shí)質(zhì)碎屑狀壞死，最可有肝炎進(jìn)展為肝硬化[1]。如下圖所示：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文表達(dá)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，膽汁流以及膽鹽、卵磷脂、膽固醇的膽汁分泌都相應(yīng)增加。然而，BSEP 基因敲除小鼠中，膽汁膽鹽輸出量明顯減少，血漿和肝臟膽汁酸濃度上升。以上實(shí)驗(yàn)表明，BSEP 對膽汁酸鹽的正常分泌起十分重要的作用。BSEP，即膽鹽輸出泵,主要存在于肝臟中,位于肝細(xì)胞的毛細(xì)膽管面，它由 1321 個(gè)氨基酸組成，分子量約 160kDa。屬于 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，人類 ABCB11 基因可編碼產(chǎn)生膽鹽輸出泵(BSEP)。如同其他 ABC 超家族全長轉(zhuǎn)運(yùn)體一樣，推測它的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一個(gè)緊密銜接的復(fù)寫結(jié)構(gòu)，每一半都由六個(gè)預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域組成[57]（圖 2）。

圖 3 BSEP 作用機(jī)制BSEP 的表達(dá)與功能受多種水平調(diào)控。ABCB11 基因啟動(dòng)子區(qū)含有反轉(zhuǎn)順序 IR-1，為法尼酯衍生物 x 受體(FarnesoidXreceptor，F(xiàn)XR)的結(jié)合位許多研究已證實(shí)在膽酸的激活下，F(xiàn)XR/RXR 異二聚體與 BSEP 啟動(dòng)子 IR-1 結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[58]。翻譯后，BSEP 蛋白還要經(jīng)過糖基化化、泛素化等修飾。蛋白質(zhì)糖基化對于正確折疊和新合成蛋白質(zhì)的穩(wěn)定至關(guān)重要，并且對蛋白質(zhì)的載荷和溶解度也有很大影響；大鼠 BSEP 的個(gè)胞外環(huán)含有 4 個(gè) N-糖基化的天冬酰胺殘基，人類 BSEP 的天冬酰胺殘存在糖基化位點(diǎn)。磷酸化作用可以影響 BSEP 定位的轉(zhuǎn)譯后修正作用等磷酸化酶可通過激活 p38MAPKs 途徑使 BSEP 從高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)移管側(cè)膜[59]。泛素化介導(dǎo)的錯(cuò)誤折疊、截?cái)鄬?dǎo)致的 BSEP 蛋白降解可能在 表面表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。最近的研究采用免疫沉淀法顯示 BSE鏈泛素相關(guān)聯(lián)，泛素化的 BSEP 半衰期縮短。表達(dá)后的 BSEP 蛋白還可
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉炬;徐兵河;;單核苷酸多態(tài)與乳腺癌患者的預(yù)后[J];癌癥進(jìn)展;2007年03期

2 ;Analysis of HLA alleles polymorphism in Chinese patients with primary biliary cirrhosis[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2006年01期

本文編號：2845191